基于微流控芯片的复方木鸡颗粒抗肝肿瘤的“谱-物-效”关系

秦 妍，包永睿，王 帅，李天娇，张秀君，孟宪生，潘海鸥

(1. 辽宁中医药大学药学院；2. 辽宁省中药多维分析专业创新技术中心，辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600；3. 丹东药业集团有限公司, 辽宁 丹东 118303；4. 辽宁中医药大学外国语学院，辽宁 沈阳 110000)

复方木鸡颗粒源自于满族民间验方“木鸡汤”，部颁标准《中药成方制剂》第十六册中记载，其具有抑制甲胎蛋白升高的作用。主要用于治疗慢性乙型病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化以及肝癌。木鸡汤此前由云芝、核桃楸皮两味药材组成，后经多年实践应用，在此基础上增添扶正祛邪的山豆根以及补益肝肾的菟丝子两味药材[1]。目前，复方木鸡颗粒文献中围绕物质基础的研究较少，主要集中在作用机制以及成分解析[2-5]方面，其中多数成果为本实验室研究所得。本实验在前期工作基础之上，针对复方木鸡颗粒抗肝癌药效物质基础不明确的问题展开了谱效学研究[6]，通过建立数学模型赋予VIP值，确定与药效呈现正相关的色谱峰。在此基础上，基于网络药理学对正相关成分进行“成分-靶点-通路”预测。故将“谱-效”分析的结果与“物”进行关联，建立“谱-物-效”分析方法，为其合理的机制阐述提供数据支撑，同时也为更好地控制其药品质量提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 仪器LSP04-1A型精密注射泵(保定兰格公司)；HPDC-32G-2型等离子清洗机(美国Harrick Plasma公司)；JKG-2A型光刻机(上海学泽光学机械有限公司)；SC-1B型匀胶机(北京创世威纳科技有限公司)；Agilent 1260液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Agilent 6550型质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)；Nikon ECLIPSE TI倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 试剂与药品复方木鸡颗粒(批号：210103)来源于辽宁丹东药业集团有限公司；细胞凋亡与坏死检测试剂盒(Hoechst33342与碘化丙啶PI)购自碧云天生物技术研究所；细胞增殖与毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit8，货号：MA0218)购自Meilunbio公司；乙腈(色谱纯，批号：20210512)购自于德国Merck公司；甲酸(色谱纯，批号：20210408)购自天津科密欧化学试剂有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自于美国Gibco公司；青霉素/链霉素溶液购自于Meilunbio公司。

1.3 凋亡特征芯片的设计与制作实验所需芯片设计为PDMS-玻璃的双层微流控芯片，从上到下依次为流体通道层以及玻璃基片层，流体通道层包括流体通道区以及多个细胞腔组成的细胞培养区，每列培养腔设置5个复孔。

1.4 芯片和孔板中生长状态比较取处于对数生长期的HepG2细胞，消化后制成浓度为5×108个· L-1的单细胞悬液，使用1 mL无菌微量注射器吸取适量细胞悬液，注入芯片细胞培养腔内，使悬液顺利进入腔内并均匀铺满管路，置于培养箱中进行孵育6 h，待其完全贴壁后，使用精密注射泵将培养液注入至培养通道中，流速设置为0.2 μL· min-1。每24 h拍照1次，通过IPP软件对细胞图像进行计数分析，取3个复孔平均值，绘制HepG2细胞芯片内生长曲线；将细胞密度调整为5×108个·L-1的单细胞悬液接种于96孔板中，每孔接种100 μL，并设置调零组。使用CCK-8法测定细胞在450 nm处的OD值，绘制HepG2细胞孔板内生长曲线。

1.5 复方木鸡颗粒不同提取方式下药液的制备提取溶剂为水(S1)、95%乙醇(S2)、氯仿(S3)、乙酸乙酯(S4)、正丁醇(S5)、甲醇(S6)、丙酮(S7)；称取复方木鸡颗粒50 g，S2 ～ S7分别加入10倍体积的提取溶剂回流提取1 h，抽滤后回收溶剂挥干，即得。精密称取上述提取物2.00 g，置于10 mL容量瓶中，制成200 g·L-1的储备液，过0.2 μm PTFE膜后转移至样品瓶中。S1称取复方木鸡颗粒2.00 g，同上述方法直接制备，供HPLC及UPLC-Q-TOF-MS分析使用；另外，采用培养液稀释为浓度为10 g·L-1的储备液，供微流控芯片药效试验使用。

1.6 复方木鸡颗粒提取物指纹图谱的测定及体外药效学评价

1.6.1HPLC色谱条件 Agilent Poroshell SB C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)进行梯度洗脱(0-13 min，1%-6% A；13-19 min，6%-8% A；19-32 min，8%-13% A；32-34 min，13%-13% A；34-44 min，13%-17% A；44-52 min，17%-21% A；52-86 min，21%-41% A)，流速0.6 mL· min-1，柱温30 ℃，UV检测器254 nm，进样量5 μL。

1.6.2体外药效学评价 取人肝癌细胞HepG2，常规培养于含10%的胎牛血清的DMEM培养液中，取对数生长期细胞接种于芯片中。待细胞贴壁后，以0.2 μL· mL-1的流速经蠕动泵给药刺激24 h，使用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染液对细胞进行双染，使用Nikon ECLIPSE TI倒置显微镜对芯片细胞进行拍照，检测S1～S7不同提取方式下药效的差异。

1.7 灰色关联分析灰色关联分析法是中药谱效关系中常用的方法之一，其主要途径是通过计算指纹图谱共有特征峰与药效之间的关联度大小，来以此确定特征峰对药效的贡献值[7]。本研究采用灰色关联度分析软件(Grey Modeling_V3.0)进行分析，以细胞凋亡坏死率作为参考序列，不同提取方式下指纹图谱共有峰峰面积作为比较序列[8]。采用灰色关联分析法，先将原始数据进行均值化处理，在获得绝对差序列以及关联系数。

1.8 UPLC-Q-TOF-MS成分解析色谱条件：Agilent Poroshell SB C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.04%甲酸水(B)；流速：0.6 mL· min-1；柱温：30 ℃；梯度洗脱程序：0-3 min，1%-6% A；3-4.5 min，6%-8% A；4.5-8 min，8%-13% A；8-9 min，13%-13% A；9-12 min，13%-17% A；12-15 min，17%-21% A；15-23 min，21%-41% A。

质谱条件：采用Dual AJS ESI离子源，正/负离子模式检测，扫描范围：m/z 100-1 500。干燥气体流速为13 L· min-1，干燥气体温度为225 ℃，正离子模式下毛细管电压为 3 500 V，负离子模式下毛细管电压为-4 000 V，雾化器压力为40 psig，碎裂电压为125 V，OCT IRF Vpp为750 V，二级质谱碰撞电压为20 eV。

1.9 谱-物-效”关系研究中物质基础成分筛选将关联系数>0.8的单体成分峰面积作为变量X，获取的不同提取方式下复方木鸡颗粒的药效数据作为变量Y，导入SIMCA 14.1软件中，经UVN标准化后，进行偏最小二乘法回归(PLSR)分析。

1.10 “活性成分-靶点-通路”网络构建通过TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、Uniprot(https：//www.uniprot.org)数据库获得上述7个成分的89个靶点以及KEGG(https：//David-d.ncifcrf.gov/home.jsp)富集的88条通路，运用Cytoscape3.7.1软件构建“成分-靶点-通路”网络。同时，采用STRING(https：//string-db.org)数据库获取核心靶蛋白，将其导入Cytoscape3.7.1运用CytoNCA插件对核心蛋白进行筛选。

Fig 1 Schematic diagram of microfluidic chip

2 结果

2.1 芯片的设计与制作本实验所需芯片包括3个入口以及3个废液口，每列细胞腔下方设置有100 μm的弯曲管道，以防止液体倒流；其长度为5 cm，宽度为4 cm，厚度为3 mm，每个腔室为椭圆形，规格是1.0 mm×1.2 mm。

2.2 芯片和孔板中生长状态比较结果HepG2细胞在鼠尾胶原包被的芯片中完全伸展，形态良好；通过比较两种培养方式，其细胞形态上并无明显差异；通过Nikon ECLIPSE TI倒置显微镜观察发现，芯片中细胞连接更为紧密，培养腔室内细胞生长环境较佳。同时能够说明流动培养能够及时清理细胞培养腔中细胞代谢物。始终为细胞提供新鲜的营养物质，充分为细胞生存提供良好的微环境。见Fig 2A和Fig 2B。

Fig 2 (A) Cell growth in chip; (B) Cell growth in pore plate

HepG2在芯片中24～168 h之间细胞数量持续增长，且在24～144 h内呈现对数增长，144～168 h增长速率相对缓慢；细胞在孔板中72 h内已经达到对数生长期，随着培养时间的延长，孔板内细胞代谢物大量堆积，在144 h后细胞数量出现下降的趋势；结果表明两种培养方式的生长规律基本一致，但芯片培养方式更有利于细胞长期培养。见Fig 3A和Fig 3B。

Fig 3 (A) Cell growth curve in chip; (B) Cell growth curve in pore plate

Fig 4 (A) Efficacy of HepG2 cells in vitro; (B) Hoechst 33342/PI double staining fluorescence detection results (×100)

2.4 复方木鸡颗粒不同提取方式指纹图谱的建立取供试品溶液按“1.6.1”色谱条件进行检测，得到7个不同提取方式下复方木鸡颗粒的指纹图谱。其中，S4作为全色谱峰。图谱信息导入中药指纹图谱相似度评价软件(2012版)。见Fig 5和Fig 6。

Fig 5 Full spectrum peak of Compound Muji Granules

Fig 6 Fingerprint of Compound Muji Granules under different extraction methods

Fig 7 Regression coefficient and VIP value analysis results

2.4.1相似度评价 利用中药指纹图谱相似度评价软件(2012版)分析，7种不同提取方式下复方木鸡颗粒指纹图谱的相似度分别为S1：0.635，S2：0.988，S3：0.939，S4：0.957，S5：0.943，S6：0.864，S7：0.405。结果表明，除S1和S7外，其余样品相似度在0.864～0.988，表明不同提取方式下峰面积以及峰数量存在明显差异，即化学成分之间存在一定的差异性。

2.4.2方法学考察

2.4.2.1精密度试验 取S1供试品粉末，以“1.5”项下方法制备供试品溶液，以“1.6.1”项下色谱条件重复进样6次，以木犀草素为参照峰，计算各峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各峰相对保留时间RSD<0.35%，相对峰面积RSD<2.74%，表明该方法精密度良好。

2.4.2.2稳定性试验 取S1供试品粉末，以“1.5”项下方法制备供试品溶液，以“1.6.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，以木犀草素为参照峰，计算各峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各峰相对保留时间RSD<0.26%，相对峰面积RSD<2.66%，表明室温条件下样品溶液在24 h内稳定。

2.4.2.3重复性试验 取S1供试品粉末，以“1.5”项下方法制备6份供试品溶液，以“1.6.1”项下色谱条件分别进样，以木犀草素为参照峰，计算各峰相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各峰相对保留时间RSD<0.42%，相对峰面积RSD<2.98%，表明该方法重复性良好。

2.5 灰色关联度分析与UPLC-Q-TOF-MS解析将细胞凋亡坏死率作为母序列，72个色谱峰峰面积作为子序列，采用灰色关联度软件展开分析，由此得到，不同提取方式色谱峰与其凋亡坏死率的关联系数。其中相关性系数>0.8的列表如Tab 1。

Tab 1 Grey correlation analysis of chemical components and pharmacodynamic indexes of Fufang Muji Granules by different extraction methods

对关联性>0.8的色谱峰进行质谱解析，共确认了11种成分，见Tab 2。

Tab 2 Preliminary examination of effective components of Compound Muji Granules

2.6 复方木鸡颗粒抗肝癌活性物质基础将Tab 2中关联系数>0.8的各成分峰面积作为变量X，获取的不同提取方式下复方木鸡颗粒的药效数据作为变量Y，导入SIMCA 14.1软件中，经UVN标准化后进行PLSR分析。其中PLSR成分数为2，模型P值为0.004 7。OPLS-DA模型中R2X=0.837，R2Y=0.726模型预测参数Q2=0.81，均>0.5，表明建立的模型有效稳定。具体VIP值见Fig 7。一般认为VIP值越大的变量其贡献也越大，其中有7个色谱峰的VIP值 > 1，包括图中48(木犀草素)、6(没食子酸)、19(绿原酸)、59(槲皮素)、67(山柰酚)、65(柚皮素)、38(鞣花酸)与药效指标呈较强的正相关(VIP>1)。

2.7 “活性成分-靶点-通路”的构建与分析“活性成分-靶点-通路”可视化网络中共有184个节点，包括木犀草素、没食子酸、绿原酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素、鞣花酸7种成分、89个靶点蛋白、88条信号通路。通过CytoNCA分析节点度值较高的前20个靶基因，度值分值均大于10，间距中心度、紧密中心度、特征向量中心度均大于中位值，在网络中筛选出与7种活性成分存在关联的靶点有：ESR1、JUN、HSP90AA1、SMAD3、FOS、AKT1、NOS3、ACTB、CEBPB、ESR2以及SMAD2，提示这些基因可能是复方木鸡颗粒治疗肝肿瘤的核心靶点(Tab 3)。KEGG富集信号通路主要涉及炎症、免疫等方面，如TNF信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、乙型肝炎信号通路(hepatits B)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等。

Tab 3 The core targets screened by CytoNCA pluggable unit

3 讨论

本研究对不同提取方式的复方木鸡颗粒进行了HPLC分析，根据色谱峰的差异，选取S4作为全谱峰，共标定72个色谱峰。经“谱-效”分析的相关性结果可知，共有14个色谱峰的相关度>0.8，UPLC-Q-TOF-MS共解析14个色谱峰中的11个成分。同时对14个色谱峰进行偏最小二乘回归分析，得到木犀草素、没食子酸、绿原酸、槲皮素、山柰酚、柚皮素以及鞣花酸7个抗肝癌活性物质基础。再对7个活性成分展开“成分-靶点-通路”网络构建，预测其潜在靶标为ESR1、JUN、HSP90AA1、SMAD3、FOS、AKT1、NOS3、ACTB、CEBPB、ESR2以及SMAD2，进一步阐述复方木鸡颗粒抗肝肿瘤的“谱-物-效”关系。

并且根据文献研究报道，上述7种药效物质单体均有抑制肝肿瘤的作用。木犀草素能促进肝癌细胞自噬，促进肝细胞凋亡[9]。没食子酸诱导SMMC-7721细胞凋亡，同时升高p53 mRNA水平和p53蛋白表达[10]。绿原酸可以抑制肝肿瘤相关巨噬细胞M2极化，且影响JAK/STAT6信号通路[11]。槲皮素能较为显著的抑制体内外HepG2肝癌细胞的增殖，并会导致其发生凋亡[12]。山柰酚对肝癌Huh7细胞生长有明显的抑制作用，且提高了细胞caspase-3的活性，与诱导细胞的凋亡有关[13]。柚皮素增强抗人DR5单克隆抗体对HepG2的凋亡作用，其可能机制为柚皮素诱导HepG2细胞表面DR5受体表达上调所致[14]。鞣花酸通过抑制CtBP、Stathmin和COX-2的表达发挥抗肝癌的生物学作用[15]。靶点作为药物治疗疾病的最小单位，并非独立个体存在，“成分-靶点-通路”网络是一个相互作用的复杂网络，通过多个通路同时发挥多重或协同作用。复方木鸡颗粒成分众多，因此，本文采用“谱-物-效”研究方法，对“谱-效”筛选出的物质基础进行“成分-靶点-通路”药理网络构建，并且富集癌症以及与细胞生长、凋亡、增殖相关的通路；FoxO signaling pathway、HIF-1 signaling pathway等与免疫相关通路；TNF signaling pathway、Hepatits B等与肝炎相关的通路。

故推测复方木鸡颗粒通过多过程、多通路共同参与抗肿瘤作用。本文从整体揭示复方木鸡颗粒对肝肿瘤的干预作用及潜在靶标，为后续深入研究复方木鸡颗粒中不同活性成分调节肝肿瘤的作用机制以及抗肝肿瘤药物的研发提供依据。