兔血浆-APTT法测定水蛭抗凝血活性的剂量-效应曲线考察和测定方法确定研究

肖斯婷，胡宇驰，郭玉东，许华玉，杨文良，李 波

(1. 北京市药品检验研究院、国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室、中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206; 2.国家药典委员会，北京 100061; 3.中国食品药品检定研究院，北京 102629)

水蛭是收载入《中国药典》的典型活血化瘀药物，其功能主治为破血通经、逐瘀消癥[1]。已有的研究证明，水蛭活性有抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、改善血液流变学、促进纤溶等，抗凝血是其最显著的药理作用[2]。研究证实，水蛭有缩短活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)的作用,在整体动物实验和离体实验均具有规律的一致性[3-4]。测定水蛭加入血浆后APTT的延长情况，可能是量化测定水蛭抗凝血活性质量控制的研究方向，命名为抗凝血活性测定法。

本文进行兔血浆-APTT法测定水蛭抗凝血活性的实验方法设计研究，先进行剂量-效应曲线考察，统计分析后选择测定方法的统计模型，并进行样品的预测定，探索出可行的量化测定水蛭抗凝血活性的方法体系。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂蚂蟥饮片，由北京康而福药业有限公司提供3批，批号分别为：20171201、20171202、20171203，采用冰冻粉碎机粉碎成100目碎末。日本医蛭药材，由贵州信邦制药股份有限公司提供4批，批号分别为：20171001、20171002、20170902、20170901。蚂蟥对照药材，批号：121061-201806，购自中国食品药品检定研究院。菲牛蛭对照药材，批号：121754-201901，购自中国食品药品检定研究院。APTT试剂，由Instrumentation Laboratory Co仪器实验公司生产，批号：N0394780。枸橼酸钠购自北京化学试剂公司。

1.2 仪器全自动血液凝固分析仪，ACLELTTE PRO，Instrumentation Laboratory Company。

1.3 动物与血浆日本大耳白家兔，购自北京隆安实验动物养殖中心，动物许可证号：SCXK(京)2019-0006。家兔颈总动脉取血，3.2%枸橼酸钠1 ∶9抗凝，2 500 r·min-1离心15 min制备血浆，将多只(3只以上)兔血浆混匀，备用。

1.4 浸提液制备与APTT值测定精密称取蚂蟥药材、日本医蛭药材以及蚂蟥、菲牛蛭和土鳖虫对照药材，加0.9%氯化钠注射液，4 ℃浸提30 min，5 000 r·min-1离心20 min，取0.1 mg·L-1上清液，再加0.9%氯化钠注射液稀释配制成不同浓度的浸提液，采用全自动血凝仪和家兔血浆，测定不同浓度浸提液的APTT值。反应体系：20 μL不同浓度水蛭浸提液，兔血浆50 μL，APTT试剂50 μL，混匀，37 ℃±0.5 ℃预温180 s，每管再加入CaCl2试剂50 μL，测定凝结时间。

1.6 测定值方差齐性分析采用1批菲牛蛭对照药材，配制成0、5、10、20、30、50 g·L-1，在同一台血凝仪上分别测定6次APTT值，对APTT和对数转换后的APTT进行方差齐性检验，分析在何种情况下测定值之间出现方差齐性。

1.7 测定体系的选择根据剂量效应值曲线呈现直线的剂量范围和测定值处理值，选择测定值方差齐性的处理模式，按照专属性好、精密度符合要求、实验量少的原则确定最佳的实验体系。

1.8 样品预测定采用对照药材作对照品，按照选定的测定体系，平行制备对照药材和药材样品的浸提液，平行测定多剂量APTT值，按照预先编制的符合要求的统计软件进行生物活性测定统计，观察曲线的特征是否符合统计学要求，初步判定测定体系的适宜性。

2 结果

2.1 剂量效应曲线特征考察4批日本医蛭和3批蚂蟥药材，不同浓度浸提液测定APTT数据列表如下。

日本医蛭制备浸提液后，随浓度的升高离体血浆的APTT值不断延长，有明显的量效关系。日本医蛭的作用较强，有的批次在0.05 kg·L-1或0.08 kg·L-1即超出了全自动血凝仪测定上限299 s；同时，不同批次之间的作用强度有较大差异。

Tab 1 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 2 Concentration-APTT determination data of 2 batches of Japanese medical leeches extract

Tab 3 Concentration -APTT determination data of 2 batches of leech extract

蚂蟥制备浸提液后，随浓度的升高离体血浆的APTT值也不断延长，有明显的量效关系。但蚂蟥的延长作用较日本医蛭弱，且APTT延长到一定浓度后延长不明显，说明蚂蟥延长APTT值有一定的上限。 对上述7批样品的测定数据进行作图，以浓度为X轴(kg·L-1)，APTT值为Y轴(s)，结果见Fig 1。日本医蛭和蚂蟥的曲线有明显不同，日本医蛭能够将APTT值延长到超过仪器测定上限，而蚂蟥的浸提液APTT延长到一定程度后会有平台期。由Fig 1可见，日本医蛭和蚂蟥药材的浓度-APTT，均不是直线，回归相关性较差。

Fig 1 Concentration-APTT curve of leeches

对上述的7批药材样品的测定数据，以浓度为X轴(kg·L-1)，以APTT值的对数值为Y轴，结果见Fig 2。可见4批日本医蛭明显成为一条直线，而蚂蟥有反应平台值，初步观察并同通过曲线拟合，可见蚂蟥0.025 kg·L-1前呈现直线关系，见Fig 3。以浓度对数为X轴(kg·L-1)，以APTT值为Y轴，结果见Fig 4。可见4批日本医蛭和蚂蟥的曲线均不是直线，R2值小于0.9，两者特征有明显不同。以浓度的对数为X轴(kg·L-1)，以APTT值的对数为Y轴，结果见Fig 5。可见4批日本医蛭数据接近直线，3批蚂蟥的数据不是直线，而低剂量下曲线接近直线。

课题组归纳出一些具体的学生创新学习方法，如自主学习、问题学习、开放学习、案例学习、课题学习和网络学习等方法[3]，增强学生探究和体验的机会。

Fig 2 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches

Fig 3 Concentration-APTT logarithmic curve of leeches (concentration 0～0.025 kg·L-1)

Fig 4 Log-APTT curve of concentration of leeches

Fig 5 Log-APTT log curve of concentration of leeches

采用蚂蟥、菲牛蛭和土鳖虫对照药材进行一系列浓度的APTT值测定，绘制曲线，蚂蟥对照药材的曲线特征与3批蚂蟥药材相似，菲牛蛭对照药材的曲线特征与4批日本医蛭药材样品相似，浓度与APTT的对数作图见Fig 6。由Fig 6可见，蚂蟥对照药材的浓度与APTT的对数在低剂量时呈现良好的线性关系，且直线通过空白对照。菲牛蛭对照药材的浓度与APTT的对数呈现良好的线性关系，且直线基本通过空白对照。土鳖虫对照药材无延长APTT的作用。从曲线考察结果来看，日本医蛭适合采用斜率比法进行效价测定，也可以采用量反应平行线法；而蚂蟥在低剂量时，适合采用斜率法和量反应平行线法。

Fig 6 Logarithmic curve of concentration-APTT for leeches, Philippine cattle leeches and Trionyx sinensis

Fig 7 APTT logarithmic data points of different dosimetry

2.2 方差齐性分析结果将菲牛蛭对照药材6个浓度浸提液分别测定6次APTT值列表，数据见Tab 4。对APTT值和对数转换后的APTT值，用SPSS 17.0软件进行方差齐性检验，结果可见对数APTT值各剂量的标准差未出现显著性差异(P=0.888)，APTT值各剂量之间的方差存在显著差异(P=0.002)，方差分析结果见Tab 5。

Tab 4 APTT data of phellodendrine leeches at different doses

Tab 5 Test results of homogeneity of variance of APTT data measured at different doses(Test of homogeneity of variances)

2.3 活性测定体系的确定综合7批药材样品和蚂蟥对照药材、菲牛蛭对照药材的量效关系曲线分析来看，在低剂量情况下，测定体系符合以下斜率比模型的特征： ① 在剂量较低的情况下，APTT值测定没有达到平台期，日本医蛭和蚂蟥药材的浓度-APTT对数值呈直线，且直线最终相交于零浓度。② 经方差齐性分析，APTT值经对数转换后，APTT测定值呈正态分布；不同剂量间生物反应的标准差不出现显著性差异，说明主要影响因素是剂量的差异。③ 所有测定样品的剂量范围内，至少有3个浓度的量-效关系满足呈直线要求。因此，从数据来分析，可采用3剂量的斜率比法进行水蛭抗凝血活性的测定。

斜率比法进行统计分析时，实验成立的条件应至少满足以下3点：① 回归分析应显著，P值应小于0.05，表明APTT测定结果随剂量出现显著差异。② 截距差异应不显著，P值应大于0.05，表明样品和对照品的曲线相交点在0浓度。③ 非线性应不显著，P值应大于0.05，表明样品和对照品的线性特征一致。

2.4 样品预测定结果采用蚂蟥对照药材做标准品，分别对3批蚂蟥和4批日本医蛭制备浸提液，稀释成5、10、15 g·L-1浓度溶液，平行测定各剂量的APTT，将测定的APTT值输入斜率比法计算模板，测定3批蚂蟥和4批日本医蛭相对于蚂蟥对照药效的相对效价，见Tab 6和Fig 8、9。

Tab 6 Statistics of slope ratio method for predicting anticoagulant activity of leeches

Fig 8 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

Fig 9 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

从预测定结果来看，以蚂蟥对照药材可以作为蚂蟥的活性测定对照品来使用，实验均成立。但不能用来测定日本医蛭的抗凝血活性，实验均不成立。

采用菲牛蛭对照药材为标准品，同时与4批日本医蛭制备浸提液，稀释成5、10、15 g·L-1浓度溶液，采用斜率比法计算模板计算4批日本医蛭相对于菲牛蛭对照药材的相对效价。见Fig 10和Tab 7。

Tab 7 Prediction results of leech anticoagulant activity by slope ratio method

Fig 10 Anticoagulant activity data of leeches by slope ratio method

3 讨论

自《中国药典》2010年版收载中药生物活性测定指导原则以来，采用生物活性测定进行中药质量控制越来越成为中药研究者的共识，国家药监局药品审评中心2020年发布了《中药生物效应检测研究技术指导原则(试行)》[5],中药标准中收载体现其临床治疗效应的量化评价、整体评价也就成为了研究的热点方向。国家药典委员会也认为，通过研究代表药物的生物活性测定方法，建立科学、合理的生物活性测定标准，可以提升我国中药质量控制的总体能力，尤其是临床大量运用、具有我国传统医学特点、基础研究非常深入的活血化瘀类药物是重点方向和可行方向[6]。但国家药典委员会同时也指出，生物检定方法在如何确认和评价方法的适用性和准确性方面存在风险，应进行生物检定方法的设计、开发及验证的关键技术研究，适当时候制定指导原则[6]。水蛭在体内和体外具有延长血浆APTT值的作用，体外延长APTT作用具有明显的随剂量增加而延长的作用，这是建立量化评价的生物活性质控方法的最好基础。课题组在2013年得到这个规律后，多年来都在尝试遵循一种科学规范过程建立科学适宜的标准，本文就是中药生物活性测定方法设计方面的一种探索。

3.1 生物活性测定方法建立的第一步是进行剂量-效应曲线的全面考察生物检定方法的统计前提是不同剂量之间的生物效应值存在显著差异、测定的效应值的决定性因素主要是剂量不同。剂量-效应曲线的全面考察需要了解的信息主要有3点：

一是曲线的极值(或者说范围)的了解，所有的药理效应都是S型或反S型的曲线,针对曲线需要了解的极值信息有：效应的最大值和最小值，高平台期和低平台期对应的剂量范围，最高效应和最低效应的差值，接近最高平台期和最低平台期的剂量差距范围，以及S型曲线是否对称。二是剂量-效应曲线的最佳拟合方程。三是测定效应值的方差齐性检验，方差不齐的应通过数学转换，包括对数转换、倒数转换等，找到计算出方差齐性的转换方法。

本文采用蚂蟥和水蛭多批次样品，进行了多次不同剂量浸提液-APTT值的测定，对剂量-效应的曲线特征的3点信息都有了明确的了解。一是极值，对蚂蟥来说存在APTT的平台期，剂量不得太大，APTT值也不能太高，在蚂蟥的极值范围内，日本医蛭具有同样的剂量-效应特点但没有极值，说明方法设计应考虑蚂蟥的APTT测定平台期的影响，也最好有能够区分蚂蟥和日本医蛭的统计方法。二是最佳拟合方程，本文尝试了APTT值、APTT对数值、剂量值、剂量对数，组合起来为4种拟合方法，基本明确在较低剂量时APTT对数值与水蛭浓度(包括水蛭浓度为零)的直线关系显著性最好。三是经过多次测定的方差齐性分析表明，各剂量之间的APTT对数值误差符合正态分布，APTT值各剂量之间的方差是不相同的，说明APTT对数值的影响因素才主要是水蛭的剂量。

剂量-效应曲线考察后，可以确定的有：Y值应该采用APTT对数值，APTT值测定注意平台期，X值可以选择剂量、或者剂量的对数。但是剂量取对数后，蚂蟥因平台期剂量范围比较小，日本医蛭在不同批次之间因活性差异平行性并不是很好，课题组一直尝试采用量反应平行线法进行测定，当时一直认为采用广泛使用的量反应平行线法是最可能的方法，未进行更多的曲线拟合，结果发现不同样品之间时常出现方法学不成立，几年的时间内方法学研究都无法完整完成。当采用规范的方法进行多种曲线模拟的时候，发现APTT平台期下最适宜的拟合曲线是剂量-APTT对数，采用量反应平行线不是最佳的方法，符合剂量-效应曲线特征的最佳方法可能是斜率比法。因此，本文研究过程也说明了生物检定方法建立的过程中遵循科学规范的重要性。

3.2 生物检定方法建立的第二步是确定剂量设计和误差控制生物检定法设计中有一个基本规律，在达到要求的准确度和精密度的前提下，应优选剂量多、实验量小的设计。斜率比法属于量反应检定法，常见的有具有空白对照的(1·k·k)法和没有空白对照的(k·k)法。根据水蛭的剂量-效应关系曲线，本法可以在APTT延长到空白对照的2～3倍的剂量区间设置3剂量，因此选择的实验设计为(1·3·3)法，样品和标准品设计3个剂量，高剂量一般在10～30 mg之间。依据斜率比法的统计原理，零剂量和3个剂量的4个数应成为等差数列。本文设计的(1·3·3)法，要求的可信限率(FL%)不得大于15%，每个剂量的实验次数m值不小于2即可达到，也即试验中配制6个浓度待测液，测定14个APTT值即可，测定工作效率精度均比较好。假设采用(2·2)法，因方法学成立统计和可信限率要求，实际需要的APTT测定次数可能更多；而采用(4·4)法，高剂量容易遇到平台期导致方法学不成立；综合来看，采用(1·3·3)是最佳方法。

生物检定法是定量药理学实验，误差控制的基本原则是要求实验操作的平行性。例如，需要注意样品配制、稀释等实验各个步骤对照品和供试品的平行性，尽量保证相同浓度的标准品和供试品稀释液的测定时间接近。测定中建议使用空白、S1、S2、S3、T1、T2、T3，空白、T1、T2、T3、S1、S2、S3的顺序进行测定，当各剂量反应个数比较多时，可重复推荐的顺序。

剂量设计中还有一个考虑点，即方法最可能成立的剂量在哪个范围。生物检定方法的标准中，一般会推荐剂量，那就是因为在方法建立的研究过程中，已经充分了解到剂量-效应曲线的特征，选择出了测定最灵敏的剂量范围，不使用推荐的剂量非常容易出现统计学不成立或误差大，例如肝素活性的显色法就推荐了剂量范围[7]。本文研究发现，对照品的S1设置在5 g·L-1左右最适合，如果S1超过10 g·L-1则大剂量容易落在平台期，方法学容易不通过。

3.3 生物检定方法建立的第三步是确定进行预实验或预测定，进一步发现方法的一些注意事项或方法特点在确定剂量设计和误差控制后，应制定标准操作规程草案，然后按照草案选择样品进行实验，可以更好观察到方法的特点，进一步细化方法的注意事项。

本文研究过程中，进行曲线考察时注意到剂量-APTT对数的曲线是经过0浓度的，初设方法是(1·3·3)法包括空白对照，希望通过空白对照的显著性检验来减少实验误差。但在实际的样品测定中，发现空白对照对测定值是没有影响，而因为样品是加入水蛭而对照中加入的是氯化钠注射液，反而会出现空白的显著性差异，因此在统计学要求中不再要求空白对照的显著性不得出现差异，操作的误差控制要求两个空白对照不得出现显著差异即可。

本文在进行样品预测定过程中，还发现日本医蛭采用蚂蟥对照药材来进行测定会出现截距的显著差异而方法学不成立，说明本法能够区分日本医蛭和蚂蟥是不同质的，方法的专属性好，进一步证明了斜率比法测定水蛭抗凝血活性是科学的。而采用菲牛蛭对照药材做对照，测定日本医蛭的抗凝血活性，4批样品虽然活性差异较大但斜率比法的方法学统计均成立，说明日本医蛭和蚂蟥均可以采用斜率比法进行活性控制，只不过需要采用各自的对照药材。

3.4 下一步的方法学研究实验设计是生物活性测定成败的关键所在[8]。本文的研究过程，说明了剂量-效应曲线应当遵循一定的规范进行充分考察，这也是找到最佳实验设计的重要步骤。当然生物检定方法种类非常多，本文叙述的过程在具体的实例中可能会有所不同。

在生物检定方法基本建立之后，需要继续遵循规范进行实验室内的方法学考察，包括专属性、精密度、准确性等，对中药生物活性测定方法来说，进行实验室间的联合验证尤为关键，只有多家实验室均能够重现的方法，测定结果的精密度符合要求，才有可能成为在标准中实际运用的方法。