肺肌成纤维细胞转化的研究新进展

朱 媚，蒋小岗

(苏州大学苏州医学院药学院药理学系，江苏 苏州 215123)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，下文简称肺纤维化，是一种终末期的慢性进展性肺间质疾病，病因不明。肺肌成纤维细胞是肺纤维化发展过程中的关键效应细胞[1]。在肺纤维化过程中，肺肌成纤维细胞分泌促纤维化生长因子，进一步促进肺纤维化发展[2]；肺肌成纤维细胞合成细胞外基质能力强，细胞外基质大量沉积导致肺结构重塑，肺泡功能丧失[3，4]。肺肌成纤维细胞由肺纤维化过程中的不同前体转化而来。除常驻肺成纤维细胞可大量转化为肺肌成纤维细胞外，肺肌成纤维细胞还可能由上皮细胞、内皮细胞、脂肪成纤维细胞、骨髓来源的循环纤维细胞、周细胞，甚至是巨噬细胞转化而来。这些细胞可被转化生长因子(transforming growth factor β，TGF-β)等激活并诱导转化为肺肌成纤维细胞，促进肺纤维化发展。目前，治疗肺纤维化的药物——尼达尼布和吡非尼酮，正是通过干预肺肌成纤维细胞转化发挥减缓肺纤维化的作用[5]。因此，探究肺肌成纤维细胞转化机制是发现肺纤维化治疗新靶点和药物的重要基础工作。本文将从机械转导、代谢、氧化应激、泛素化、细胞衰老等方面总结近5年关于肺肌成纤维细胞转化的相关机制及药物干预的研究进展。

1 机械传导

基质硬化是肺纤维化的显著特征，也是肺纤维化的驱动因素，肺肌成纤维细胞和硬化的细胞外基质之间的机械相互作用加剧肺纤维化发展[6]。基质有生物活性，能与细胞通讯，细胞感知基质力学性质变化，激活下游生化信号通路。机械传感器位于细胞膜上，常见的有整合素、机械敏感离子通道和G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)等。

整合素是参与细胞间和细胞基质信号通路的跨膜受体，每个整合素通常由1种α亚单位和1种β亚单位非共价配对形成，至今已发现20多种不同异二聚体。整合素可调控关键促纤维化细胞因子TGF-β的释放和激活，该过程主要涉及含αV的整合素。肺肌成纤维细胞是肺纤维化过程中的主要效应细胞，表达多个含αV的整合素。因此，相当长的一段时间内αV整合素与肺肌成纤维细胞、肺纤维化的关系得到了更多关注。直到最近，Chen等[7]系统研究了α6整合素作为一种机械敏感的整合素亚单位介导基质硬度，调节肺肌成纤维细胞侵袭及肺纤维化。α6整合素结合β1整合素介导MMP-2依赖性基膜中IV型胶原的细胞周蛋白水解，导致肺肌成纤维细胞侵袭。而特异敲除间质细胞中的α6或者药理阻断基质硬度调节的α6表达能明显改善博来霉素诱导的实验性小鼠肺纤维化。他们的研究首次证实，α6整合素是一种基质硬度调节的机械敏感分子，可促进肺肌成纤维细胞侵袭介导实验性肺纤维化。因此，靶向α6-整合素可为发现新的抗肺纤维化治疗药物提供新靶点。

机械敏感离子通道敏锐感知细胞膜周围机械力环境，将其转化为电化学信号，介导下游信号传导。TRPV4(transient receptor potential vanilloid 4)作为一种非选择性阳离子通道，被发现在肺纤维化患者的肺成纤维细胞中上调，而敲除TRPV4小鼠可明显减轻博来霉素诱导的肺纤维化。Grove等[8]发现，TRPV4通过与磷脂酰肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)相互作用促进人和小鼠肺肌成纤维细胞的转化。在此过程中，TGF-β诱导TRPV4-PI3Kγ复合物向质膜募集，并增加TRPV4和PI3Kγ活性。通过功能获得或缺失的方法发现，TRPV4和PI3Kγ蛋白都是肺肌成纤维细胞转分化所必需的。更重要的是，在缺乏PI3Kγ的细胞中表达各种突变形式的PI3Kγ催化亚单位(p110γ)，发现只有p110γ的非催化氨基末端结构域是TGF-β诱导的TRPV4质膜募集和肺肌成纤维细胞转分化所必需。鉴于TRPV4和PI3Kγ都具有丰富的功能调节作用，通过靶向它们的相互作用或能提供一种肺纤维化治疗新策略。

GPCRs是人类基因组中最大的细胞膜受体家族，是目前临床药物应用最多的靶点，其相关抑制剂和激活剂均正被探索用于肺纤维化疾病的治疗。但目前以GPCRs为靶点的候选药物选择性不够，因此，发现在肺肌成纤维细胞上选择性表达的GPCRs有可能提供一种靶向方法。最近，Tschumperlin实验室发现，Gαs偶联多巴胺受体D1(DRD1)选择性在肺成纤维细胞中表达。DRD1激动可选择性地抑制肺成纤维细胞中的Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)和转录共激活子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)功能，这正好解决了非选择性抑制YAP/TAZ所致肺纤维化恶化的缺陷，将其功能从促纤维化转变为改善肺纤维化。另一方面，芳香族L-氨基酸脱羧酶(DOPA脱羧酶，DDC)是负责多巴胺生物合成最后一步的酶，在特发性肺纤维化受试者的肺组织中表达减少，其表达水平与疾病严重程度呈负相关，与肺纤维化中多巴胺信号削弱内源性保护作用一致。因此，靶向肺肌成纤维细胞DRD1靶点进而选择性抑制肺肌成纤维细胞中的YAP/TAZ信号可为以GRCPs为靶点发现新型肺纤维化治疗药物提供一条独特的途径。

非肌性肌球蛋白重链9(non-muscle myosin heavy chain 9，，MYH9)基因编码非肌性肌球蛋白ⅡA的重链，是机械传导的重要信号分子。MYH9与肌动蛋白结合，水解ATP产生机械能，在胞质流动、物质运输、肌肉收缩等多种生理活动中发挥重要的作用。cDNA芯片和蛋白组学数据显示TGF-β刺激的肺成纤维细胞以及纤维化肺组织中MYH9表达明显增加。Sun等[9]发现，在肺肌成纤维细胞转化过程中，TGF-β1通过激活ALK5/Smad2/3信号而导致MYH9表达增加；MYH9敲低或MYH9抑制剂均能显著阻抑TGF-β1诱导的肺肌成纤维细胞转化。然而，开发以MYH9为靶点的抑制剂用于肺纤维化治疗仍有较多的工作需要开展。其一，MYH9抑制剂是否可以改善体内肺纤维化；其二，MYH9抑制剂是否会破坏肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞的正常生理功能；其三，MYH9是广泛分布的蛋白质，其脱靶作用是否会产生严重不良反应。这些问题的解决将可能为发现MYH9选择性抑制剂治疗肺纤维化提供有益的线索。

2 代谢

代谢失调与肺纤维化发展息息相关，如糖酵解增加，谷氨酰胺分解增加和脂质生成减少，可能是肺成纤维细胞活化的重要驱动因素。

糖酵解不仅对能量供应至关重要，对协调辅助生物合成途径以提供细胞生长和分化所必需的元素也至关重要。在活化的肺成纤维细胞中，参与糖酵解的限速酶显著上调。TGF-β通过加快线粒体生物发生和糖酵解促进肺成纤维细胞转化[10]。缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α)是糖酵解酶表达的主要调节因子和在缺氧条件下驱动糖酵解的关键转录因子，糖酵解增强导致琥珀酸增加，稳定HIF-1α并促进肺肌成纤维细胞转化。已有研究表明，HIF-1α激活与谷氨酰胺酶的调控密切相关。Bernard等[11]在此基础上研究发现，在肺成纤维细胞中，TGF-β通过Smad3和p38MAPK途径诱导谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)亚型GLS1的表达促进谷氨酰胺转化为谷氨酸，从而促进肺肌成纤维细胞转化，而抑制谷氨酰胺分解，减少细胞外谷氨酸，则可阻止TGF-β1诱导的肺肌成纤维细胞转化。在肺肌成纤维细胞转化后去除细胞外谷氨酸可降低HIF-1α表达，逆转TGF-β1诱导的代谢重编程。因此，在肺肌成纤维细胞转化中HIF-1α是有氧糖酵解和谷氨酰胺分解代谢中的重要调节因子，为调控代谢重编程逆转肺肌成纤维细胞转化奠定有益的基础。

除了糖酵解与谷氨酰胺代谢与肺纤维化密切相关，脂质生成减少也是代谢相关的调节因素之一。超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acid，Elovl6)是一种催化脂肪酸延伸的限速酶，小鼠缺乏这种酶会导致肺泡壁自发性增厚，增加博来霉素诱导肺纤维化的易感性。增加脂质生成可降低小鼠肺内质网应激并减轻纤维化重构[12]，这是探究肺纤维化治疗靶点的潜在方向。

代谢重编程过程中，能量代谢变化是最直接的表现，而能量调节因子正是最熟悉的腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)。在肺纤维化小鼠和肺纤维化患者的肺成纤维细胞中AMPK活性下降，而AMPK激活剂，如二甲双胍，可下调Smad2/3的磷酸化和TGF-β诱导的下游基因表达水平，如结缔组织生长因子和白细胞介素-6等，从而抑制肺纤维化[13-14]。AMPK不仅调节能量稳态，还调节应激反应，AMPK激活抑制TGF-β诱导的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)表达。尽管目前研究表明，AMPK激活有助于缓解肺纤维化，但由于AMPK是多功能调节因子，脱靶效应可能会影响AMPK激活剂治疗效果，所以发现靶向肺成纤维细胞AMPK激活剂或许是肺纤维化治疗更好的选择。

3 氧化应激

氧化应激是机体高活性物质的产生超出机体的清除能力，导致氧化/抗氧化失衡的一种状态。生理范围内的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在调节人体正常生理功能(如细胞凋亡、基因表达、信号转导等)上有重要的作用。然而，当ROS 持续高浓度存在时，机体发生氧化应激反应，激活身体的修复和防御机制，损害肺组织，加速肺纤维化进展[15]。早在1987年就有研究发现，氧化应激与特发性肺纤维化(IPF)的关系，Li等[16]从IPF患者的支气管肺泡灌洗液中检测到大量脂质过氧化物。在肺中与氧化应激调控相关的酶主要是NOX 家族。NAPDH氧化酶4(NOX4)诱导ROS产生在TGF-β诱导的肺肌成纤维细转化过程中发挥重要作用。核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是体内抗氧化反应元件的主要调节物。靶向Nrf2/谷胱甘肽信号可缓解肺纤维化，如丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)通过激活Nrf2抑制细胞增殖，阻止肺肌成纤维细胞激活[17]。NOX4和Nrf2调控线粒体的生物发生和代谢，这可能是NOX4和Nrf2调节肺纤维化的机制之一。氧化应激是目前肺纤维化药物研究中的经典药物靶点，但抗氧化应激药物在临床治疗中效果并不理想，因此，发现未知的氧化应激调控因子可能是解决目前问题的必须工作，这可能为寻找新的有效的氧化应激调控药物治疗肺纤维化提供新的线索。

4 泛素化

泛素-蛋白酶体通路是调节蛋白质降解与功能的重要系统，参与细胞周期调控、细胞信号转导、细胞凋亡、抗原提呈等多种生理过程，有助于维持细胞稳态。E3泛素连接酶和去泛素化酶(deubiquitination enzymes，DUBs)调控肺纤维化相关蛋白的泛素化降解，影响肺肌成纤维细胞转化过程。在肺纤维化领域，关于Smads泛素化研究较多，E3泛素连接酶Smurf介导Smad2/3泛素蛋白酶体降解，从而抑制TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞转化，而tetratricopeptide repeat domain 3可促进Smurf的降解，增加Smad2/3表达从而逆转这一过程[18]。更为有意义的是，Tsubouchi等[19]首次在阿奇霉素缓解肺纤维化作用中将泛素化调节与氧化应激联系起来。阿奇霉素能明显抑制肺肌成纤维细胞转化中NOX4表达水平，这与阿奇霉素可增加E3泛素连接酶STUB1而促进NOX4泛素化降解密切相关。除了E3泛素连接酶参与肺肌成纤维细胞转化外，具有去泛素化作用的DUBs也是一类调控肺肌成纤维细胞转化相关的重要因子[20]。以泛素-蛋白酶体系统为基础的蛋白降解靶向嵌合体技术(proteolysis-targeting chimeras，PROTAC)是目前广泛开展的药物研发技术，但受限于用在PROTAC的泛素连接酶较少，因此，发现新的调控肺肌成纤维细胞转化的泛素连接酶将为以新策略发现肺纤维化治疗的药物新靶点和候选药物发现的基础工作，同时，PROTAC技术应充分考虑靶向性问题，减少脱靶的发生。

5 细胞衰老

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，伴有异常分泌细胞衰老相关因子的情况。然而，目前人们对细胞衰老是如何参与特发性肺纤维化的发展仍不清楚。已有研究表明，特发性肺纤维化患者肺脏组织中存在衰老的肺成纤维细胞。Alvarez等发现肺纤维化患者肺成纤维细胞发生衰老后，将产生凋亡抗性不易被清除，而其不断分泌的细胞衰老相关的分泌表型因子可能促进肺肌成纤维细胞转化，驱动肺纤维化进程。随后，Bernard等[21]发现mTORC2激活诱导肺成纤维细胞衰老进而促进肺肌成纤维细胞转化，反过来肺成纤维细胞衰老亦可激活mTORC2进而使肺肌成纤维细胞转化增加，最终促进肺纤维化进程。

已有证据表明，清除衰老肺成纤维细胞可能是特发性肺纤维化潜在治疗方法。基于这一理念，Zhang等[22]筛选到罗红霉素可能通过靶向清除衰老的肺成纤维细胞改善肺纤维化，他们研究发现，罗红霉素通过诱导衰老肺成纤维细胞凋亡和抑制衰老相关分泌表型(SASP)因子的表达，进而减少肺成纤维细胞转化，最终缓解肺纤维化。该研究进一步支持以细胞衰老为靶点治疗特发性肺纤维化是一种有希望的方法的观点。2022年，Ritzenthaler等[23]鉴定了一个新的调控肺成纤维细胞衰老促进肺肌成纤维细胞转化的因子——Slc7a11，Slc7a11在老年细胞中的表达降低与衰老标志物升高和促纤维化基因表达增加呈现负相关，并发现Slc7a11诱导剂能明显改善肺肌成纤维细胞衰老。这些研究有利于从多角度发现肺纤维化新的治疗药物，加快肺纤维化药物发现的进程。

6 总结与展望

肺肌成纤维细胞是肺纤维化发生过程中的关键效应细胞，其活性决定组织是否会因为过度修复导致肺纤维化的发生。抑制肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化是治疗肺纤维化的有效措施，目前已有的治疗肺纤维化的药物尼达尼布和吡非尼酮也正是通过干预肺肌成纤维细胞转化过程发挥治疗效果。靶向肺肌成纤维细胞转化也是筛选肺纤维化活性化合物的重要途径[24-25]。

尽管肺成纤维细胞转化的分子机制已有较好的研究进展，正如前文所述在机械转导、代谢、氧化应激、细胞衰老、泛素化等方面阐述了肺肌成纤维细胞转化的过程，然而这些与肺肌成纤维细胞转化的复杂调控过程相比，尚有很多工作有待开展。肺肌成纤维细胞转化的机制研究也存在一些问题，比如肺肌成纤维细胞中基质蛋白含量高，影响低丰度关键调控因子的发现；GRCRs、蛋白激酶等关键药物靶点与肺成纤维细胞关系的研究仍远不能满足肺纤维化药物发现的需要。最关键的是，如何调控肺肌成纤维细胞重编程，改善甚至逆转肺成纤维细胞灶，在此基础上，如何实现肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞、肺泡毛细血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞等肺泡微环境的稳态和平衡，这是实现最终治愈肺纤维化疾病的根本问题。因此，今后研究工作中，既要重点专注阐明肺肌成纤维细胞转化的分子机制，也要关注肺成纤维细胞与其他类型细胞的相互作用。