苦参碱衍生物ZS10基于PI3K/AKT信号通路诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡

王 湘，张 森，韩科研，曾攀科，李雪娇，王立升

(广西大学医学院，广西 南宁 530004)

原发性肝癌是人类消化系统最常见的癌症之一, 在我国为高发癌症，具有恶性程度高、复发率高、转移率高的特点[1]。临床治疗多采用手术、放疗、化疗以及免疫疗法。虽然随着酪氨酸激酶抑制剂的出现，患者的存活率得到了很大改善，但仍然伴有新的问题，如耐药性问题等[2-3]。因此，研发能够有效地抑制肝癌细胞增殖和转移的新型化学药物，克服其耐药性，具有重大意义。

AKT是一种在人类癌症中通常被激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，被认为与细胞增殖、转移、凋亡和癌变有关[4],PI3K/AKT信号通路通过调节多种与细胞相关的通路，在肿瘤发生中发挥重要作用[5]。AKT激活后，能够转移至细胞核和细胞质，同时激活细胞增殖、转移、周期、凋亡相关靶点，这些机制不是孤立的，可能在肿瘤发生过程中共存。因此，PI3K/AKT可能是肝癌治疗的关键部位。

苦参碱(Matrine，Fig 1)是豆科植物苦参(SophoraflavescensAit.)、苦豆子(S.alopecuroidesL.)等中草药活性成分的单体提取物，其化学式为C15H24N2O，具有喹诺里西啶结构。已经上市的复方苦参注射液作为一种抗癌药物，可与其它抗癌药物联合治疗肝癌和非小细胞肺癌[3,6-8]。临床研究表明，将标准疗法与苦参碱联合使用，癌症患者的生活质量和免疫功能得到了极大的改善[9-10]。由于苦参碱具有良好的溶解性、安全性和柔韧性结构，已被认为是一种理想的先导化合物[11]。苦参碱衍生物ZS10(Fig 1)，具有较好的体外抗肿瘤活性。本文报道了ZS10的合成，以及ZS10对BEL-7402细胞增殖，周期和凋亡的影响，基于PI3K/AKT通路对相关蛋白进行了初步研究，为ZS10进一步开发成为临床药物奠定了基础。

Fig 1 The structural formula of matrine and its derivative ZS10

1 材料

1.1 细胞株人肝癌细胞BEL-7402，人正常肝细胞LO2由广西中药药效研究重点实验室提供。

1.2 药品与试剂苦参碱为陕西昂盛生物医药公司产品；二氯甲醚、无水四氯化锡、1-氟萘均为萨恩化学技术(上海)有限公司产品；乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷均为广东汕头市西陇化工股份有限公司产品；氢化钠为国药集团化学试剂有限公司产品，四氢呋喃为成都市科龙化工试剂厂产品；RPMI 1640高糖培养液为美国赛默飞公司生产；胎牛血清为杭州四季青公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)为美国默克公司产品；蛋白质定量试剂盒(BCA)试剂盒，LDH乳酸脱氢酶试剂盒为上海碧云天生物科技有限公司生产产品；凋亡抑制剂Z-VAD(OH)-FMK(Z-VAD-FMK)(HY-16658)，丝裂霉素购于中国MedChemExpress公司；Cyclin D1、CDK2、EGFR、N-codherin、E-codherin、Vimentin、Bax、Bax、caspase-3、caspase-9为艾博抗(上海)贸易有限公司生产；4%细胞组织固定液(多聚甲醛)为北京索莱宝生物科技有限公司生产；碘化丙啶/核糖核酸酶染色缓冲液(PI/Rnase)细胞周期试剂盒为上海拜力生物科技有限公司生产；膜联蛋白-V/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒为上海拜力生物科技有限公司生产。

1.3 主要仪器高内涵细胞成像分析系统(美国PerkinElmer公司)；高通量酶标仪筛选系统(美国PerkinElmer公司)；高速离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司；倒置显微镜(OLYMPU奥林巴斯公司)；生物安全柜(Thermo)；细胞计数仪(Bio-Rad公司)；细胞培养箱(德国Binder 公司)；Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1 化学合成将10 g(100 mmol)2,2,2-三氟乙醇和14.3 g(140 mmol)三乙胺溶于无水120 mL乙醚中。在室温下加入适量17.2 g(90 mmol)甲苯磺酰氯。搅拌混合物约48 h，直到甲苯磺酰氯完全反应。过滤，用30 mL×2乙醚洗涤滤饼。将滤液浓缩。用硅胶柱层析法，正己烷 ∶乙醚=9 ∶1为洗脱剂，得2,2,2-三氟乙基-4-甲基苯磺酸酯。

氮气保护，将34 g(236 mmol)1-萘酚、40 g(157 mmol)2，2，2-三氟乙基对甲苯磺酸酯、33 g(240 mmol)碳酸钾和80 mL二甲基亚砜的悬浮液，100 ℃加热搅拌12 h。冷却后，加入100 mL水和200 mL甲苯，分离出有机层。有机层用100 mL 5%氢氧化钠水溶液洗涤5次，再用100 mL水洗涤4次，浓缩得到36 g油状物质。在真空条件下蒸馏，得28 g 1-(2，2，2-三氟乙氧基)萘，产率76%。

Fig 2 Synthetic route of matrine derivative ZS10

在0 ℃、氮气保护条件下，7.47 g(65 mmol)1,1-二氯甲醚溶于30 mL二氯甲烷中，缓慢滴加16.94 g(65 mmol)无水四氯化锡，保持0 ℃反应1 h，溶液变为淡黄色，将7.458 g(32.5 mmol)1-(2，2，2-三氟乙氧基)萘溶于20 mL二氯甲烷并注入反应液中，然后反应液从冰浴条件下缓慢加热至室温，过夜搅拌，反应结束后加入100 mL冰水，分离出有机相，水洗多次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得8.86 g粗品，经快速硅胶柱层析纯化得8.83 g白色固体，即化合物4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛，产率93%。

于100 mL圆底烧瓶中分别加入2.8 g(116 mmol)氢化钠、50 mL无水四氢呋喃，搅拌均匀，加入1.24 g(5 mmol)苦参碱，回流，加入2.5 g(10 mmol)4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛，TLC检测反应至终点。冷却，用3N的盐酸调节反应液至中性。20 mL×3二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤、浓缩，得黄色油状物。经硅胶柱层析，V乙酸乙酯 ∶V石油醚=5 ∶4纯化得白色粉末固体，即14-[1-(4-三氟乙氧基)萘甲烯基]苦参碱，乙酸乙酯-甲醇重结晶得1.81 g白色粉末，产率44%。

2.2 细胞培养人体肝癌细胞系BEL-7402用RPMI 1640培养基外加10%胎牛血清(Gibco,CA,USA)和1%青霉素/链霉素双抗(Gibco,CA,USA)培养，细胞培养在37 ℃、5% CO2培养箱中。

2.3 MTT法检测ZS10对细胞增殖-毒性影响取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于96孔板(1×107·L-1)，每孔加入100 μL培养基，37 ℃孵育24 h，贴壁。设置给ZS10实验组(有细胞+不同浓度的ZS10)、空白组(不含细胞，用于调零酶标仪)、阴性对照组(有细胞，无ZS10的培养基)、苦参碱对照组(有细胞+不同浓度苦参碱)、阳性药对照组(有细胞+不同浓度伊替立康)，抑制剂对照组(有细胞+ZS10+Z-VAD-FMK)。设置药物组浓度均分别为：0、0.5、1、2、4、6、8、16、32、64 μmol·L-1，每个浓度设置3个复孔。分别培养24 h、48 h 和72 h。配制5 g·L-1的MTT溶液，每孔加10 μL MTT孵育4 h。弃上清液，每孔加200 μL二甲基亚砜，振荡10 min，酶标仪检测OD值，重复实验3次。

抑制率/%=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)]×100%

取对数生长期LO2细胞，同上操作。

2.4 微板法检测BEL-7402细胞 LDH 释放率取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于96孔板(1×108L-1)，孵育24 h后，贴壁，分别加入含浓度为1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10的无血清培养基，置于培养箱中培养48 h后，将细胞分为背景空白对照组、样品对照组、样品最大酶活性对照组、给药组，每组设5个复孔，收集细胞培养液，按照试剂盒说明书进行样本处理，在450 nm测定LDH吸光度值，进行计算。

2.5 DAPI染色取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于6孔板(1×108L-1)，37 ℃孵育24 h，贴壁，分别加入含浓度为1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10的培养基，置于培养箱中培养48 h后，吸除培养基，PBS清洗1遍，使用多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗2遍，加入DAPI溶液，染色10 min，PBS清洗2遍，采用高内涵细胞成像分析系统进行拍照分析。

2.6 划痕实验取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，贴壁。吸弃培养基，用不含胎牛血清的培养基饥饿细胞6 h，用0.5 mg·L-1丝裂霉素处理细胞3 h，用100 μL枪头均匀于6孔板背面划痕，宽度一致，PBS清洗3次，用不含胎牛血清的培养基稀释ZS10。稀释后的ZS10浓度为：0、1、2、4、6、8 μmol·L-1。给药后，采用荧光倒置显微镜在0 h，24 h、48 h拍照。

2.7 克隆形成实验取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于6孔板上(500 mL)，24 h后弃去原培养液，分别加入浓度为1、2、4、6、8 μmol·L-1的ZS10培养基，置于培养箱中培养6 d后，终止培养，弃去培养基，磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min后，结晶紫染色，PBS冲洗，室温风干，采用菌落计数分析系统拍照并计数。

2.8 流式细胞术检测细胞周期取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，贴壁。胰酶消化成细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，尽可能吸尽上清液。PBS吹打洗涤细胞，1 000 r·min-1离心5 min弃上清液，重复2次后，70%乙醇固定，4 ℃放置12 h，1 000 r·min-1离心10 min后弃上清液，PBS清洗并离心2次，弃上清液后加入5 μL的碘化丙啶(PI)染液混匀，避光室温孵育30 min，采用流式细胞仪进行细胞周期分析。

2.9 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种于6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，贴壁。经1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10干预48 h后，胰酶消化，1 000 r·min-1离心5 min，收集细胞，弃上清液，加入195 μL染色缓冲液(binding buffer)重悬细胞，5 μL碘化丙啶(PI)，混匀，孵育15 min，采用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。

2.10 Western blot检测ZS10对BEL-7402细胞PI3K/AKT通路及相关蛋白表达水平的影响取对数生长期BEL-7402细胞，胰酶消化，种6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，贴壁。胰酶消化，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加含1% 蛋白酶抑制剂的裂解液吹打，冰上放置30 min，4℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清液，用蛋白定量法测定蛋白含量。采用湿式转印法将蛋白转印到聚偏二氟乙烯膜(95 mA湿转150 min)，封闭1 h，采用一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育1 h，充分洗膜后，显色，凝胶成像系统中成像，采用Image Lab软件对条带灰度值进行分析，每组重复检测3次，取平均值。

3 结果

3.1 ZS10化学合成在强碱氢化钠作用下，苦参碱与4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛在无水四氢呋喃溶液中回流，经缩合、脱水反应制得相应的目标化合物。

m.p.204.5-206.9 ℃;1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ: 8.24(dd, J=7.4, 1.6 Hz,1H), 7.63(dd, J=7.3, 1.7 Hz,1H), 7.53(td, J=7.5, 1.6 Hz,1H), 7.48(td, J=7.4, 1.6 Hz,1H), 7.37(d, J=1.3 Hz,1H), 7.33(d, J=7.5 Hz,1H), 7.00(d, J=7.5 Hz,1H), 5.20～5.04(m,2H), 3.98 (dd, J=12.4, 6.6 Hz,1H), 3.07～2.90(m,4H), 2.19(dtd, J=14.3, 7.1, 1.1 Hz,1H), 2.15～2.03(m,3H), 1.87～1.78(m,1H), 1.72～1.61(m, 4H), 1.56～1.44 (m, 5H), 1.44～1.32(m,1H), 1.18～1.03(m,2H);13C NMR (125 MHz, Common NMR Chloroform-d) δ 172.97, 155.81, 133.98, 133.50, 132.48, 130.08, 129.09, 128.54, 126.80, 126.22, 125.40, 123.55, 109.15, 57.11, 57.04, 56.27, 47.17, 42.39, 35.84, 27.71, 25.84, 23.90, 23.58, 21.78, 21.37。

3.2 ZS10对BEL-7402细胞增殖能力的影响不同浓度ZS10干预24 h、48 h、72 h后，MTT法检测结果显示，与空白组比较，ZS10对BEL-7402细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05)。随着ZS10浓度逐渐增加，其对BEL-7402细胞抑制率也逐渐增加，呈剂量依赖性。MTT结果显示，ZS10作用于BEL-7402细胞24、48、72 h后，半数抑制浓度(IC50)分别为(17.02±2.25)、(6.62±1.11)、(5.72±0.8) μmol·L-1(Fig 3A)，相比之下，苦参碱作用于BEL-7402细胞24、48、72 h后，半数抑制浓度均远大于100 μmol·L-1,见Fig 3C。ZS10药物浓度小于8 μmol·L-1时，与苦参碱相比，ZS10对人正常肝细胞无明显毒性，见Fig 3B。Z-VAD-FMK是一种泛caspase抑制剂，能够抑制caspase家族蛋白酶活性，同时阻断线粒体途径和死亡受体途径的凋亡。将抑制剂与ZS10联合使用作用于BEL-7402细胞，癌细胞活力明显升高，见Fig 3D。乳酸脱氢酶主要位于细胞质中，其存在于细胞外培养液中可用于检测细胞膜完整性的破坏。结果表明，不同浓度的ZS10作用于BEL-7402细胞48 h后，LDH释放呈剂量依赖性,见Fig 3E。

Fig 3 A: Effect of ZS10 on viability of BEL-7402 cells; B: Toxicity of ZS10 on human normal liver LO2 cells; C: Effect of matrine on viability of BEL-7402 cells; D: Effect of combination of ZS10 and Z-VAD-FMK on viability of BEL-7402 cells; E: Cytotoxicity detected by lactate dehydrogenase (LDH) assay (48 h) n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

由此可得，对苦参碱14位的改造能够明显提升抗肿瘤活性，ZS10对BEL-7402细胞的增殖具有明显的抑制作用，能够诱导细胞凋亡。

根据上述结果，由于ZS10在48 h和72 h的IC50相差不大，药物浓度超过8 μmol·L-1时，对人正常肝细胞具有毒性，综合考虑，为确保ZS10对肝癌细胞增殖有抑制作用且对正常肝细胞无毒，ZS10给药时间选择48 h,药物浓度选择0、1、2、4、6、8 μmol·L-1进行后续实验。

3.3 ZS10对BEL-7402细胞的形态学变化的影响DAPI染色实验结果表明，ZS10干预BEL-7402细胞24 h后，随着ZS10浓度的增加，显示与凋亡相关的明显形态学改变，细胞核大小不一，核固缩，染色质凝聚成团，进一步导致死亡，见Fig 4。

Fig 4 Effect of ZS10 on morphology of BEL-7402 cells(×40)

3.4 ZS10对肝癌细胞BEL-7402迁移能力的影响细胞划痕实验结果表明，ZS10能明显抑制BEL-7402细胞的迁移，呈现出浓度依赖性。与空白组相比，在24 h和48 h，各实验组BEL-7402细胞的迁移能力均明显下降。

Western blot实验结果表明，ZS10能明显下调N-cadherin、Vimentin和EGFR蛋白的表达，并同时明显上调E-cadherin蛋白的表达，且呈浓度依赖性，见Fig 5。

Fig 5 Effect of ZS10 on migration ability of BEL-7402 cells n=3)

3.5 ZS10对BEL-7402细胞克隆形成的影响克隆形成实验结果表明, 随着ZS10给药浓度的增加, BEL-7402细胞的集落形成数量逐渐减少，呈剂量依赖性。与空白组相比，各实验组BEL-7402细胞的集落形成数量均明显下降，见Fig 6。

Fig 6 Colony formation of BEL-7402 cells inhibited by ZS10 ( n=3)**P<0.01 vs control group.

3.6 细胞周期实验经ZS10处理的BEL-7402细胞，与空白组相比，细胞周期S期比例明显增加，G2期明显下降。ZS10处理24 h后，随着ZS10的浓度逐渐增加，细胞周期发生明显变化，G0/G1期的细胞比例基本保持不变，S期的细胞比例从(37.27±1.54)%增加至(50.49±0.76)%，G2/M期细胞比例从(25.66±0.67)%减少至(12.1±0.55)%。

采用Western blot检测参与S期阻滞的调控因子，ZS10能明显抑制周期相关蛋白Cyclin D1和CDK2的表达，且呈现出浓度依赖性，见Fig 7。

Fig 7 Effect of ZS10 on cell cycle distribution arrest of BEL-7402 cells ( n=3)

3.7 细胞凋亡实验分别取0、1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10给药48 h，BEL-7402细胞的凋亡率由(3.451±0.316)%明显增加至(50.16±2.1)%，处于早期凋亡的细胞比率明显增加为(17.1±1.4)%。根据实验结果显示，ZS10能够在BEL-7402细胞内诱发细胞凋亡，并且随着ZS10作用浓度的增加，细胞凋亡的比例也明显增加。

Western blot实验结果显示，与对照组相比，ZS10下调了BEL-7402细胞中PI3K、AKT、P-AKT，以及抗凋亡Bcl-2蛋白，上调了BEL-7402细胞中促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9蛋白的表达(P值均<0.05)，见Fig 8。

Fig 8 Effect of ZS10 on cell apoptosis of BEL-7402 cells n=3)

4 讨论

本实验室选用2,2,2-三氟乙醇和甲苯磺酰氯为起始原料，参考文献中的方法，成功合成了4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛，收率较高。进一步与苦参碱反应，得到苦参碱衍生物ZS10。最后一步反应需要在保证无水的条件下才有利于反应发生。另外，回流温度有利于提高收率。ZS10中含有三氟乙氧基，使化合物脂溶性大大增强。同时，经MTT实验验证，ZS10明显抑制BEL-7402细胞增殖,且对正常肝细胞无明显毒性。

肝癌死亡率高的主要原因是肝癌细胞的转移，细胞迁移能力可反映癌细胞在体内的转移能力。划痕实验是在体外考察细胞迁移运动能力最经典的实验之一，采用划痕实验考察了ZS10对BEL-7402细胞迁移能力的影响(Fig 5A)，ZS10明显抑制BEL-7402细胞的迁移。采用Western blot实验考察ZS10对BEL-7402细胞上皮间质转化(epithelial-mes-enchymalt transition, EMT)过程的影响，研究结果表明，在肝癌患者中，上皮表型标志蛋白E-cadherin 低表达，而间质表型标志蛋白N-cadherin高表达，这与肝癌的预后效果不佳密切相关(Fig 5C)，ZS10抑制PI3K、AKT、p-AKT、N-cadherin以及Vimentin的表达，且呈剂量依赖性，同时抑制EGFR的表达，并促进E-cadherin的表达，从而抑制细胞迁移。

细胞周期与细胞增殖密切相关，S期是细胞DNA合成的关键时期，S期阻滞可使细胞增殖周期延长，增殖速度减慢。实验结果显示，与空白组相比，ZS10使BEL-7402细胞周期S期明显增加，G2/M期细胞相应减少，诱导S期阻滞。因此，ZS10抑制BEL-7402细胞增殖的机制之一可能是延长细胞周期。在癌细胞增殖中，PI3K激活AKT信号通路，调控G1，G2细胞周期进展和Cyclin D1的表达，促进癌细胞生长[12]。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)与相应的细胞周期蛋白复合物参与细胞周期进展。Cyclin D1和CDK2作为细胞周期调节因子[13]，Cyclin D1在多种肿瘤细胞中都呈现过度表达,是多种人类原发性肿瘤的特征之一，具有重要的参考意义。ZS10能够抑制AKT、p-AKT、Cyclin D1和CDK2表达，呈浓度依赖性下调，进而调节癌细胞周期，诱导BEL-7402细胞S期阻滞。

AKT的磷酸化可以调控Bax、Bcl-2蛋白表达，Bax和Bcl-2是细胞凋亡的主要调控蛋白之一[14]，据报道，Bcl-2可自制细胞色素C释放到胞质中，并与其同源物一起维持线粒体膜的完整性[15]，在细胞内二者通常以二聚体形式发挥作用[16]，通过二者比值，可以判断细胞凋亡状态。比值升高导致线粒体外孔膜形成，细胞色素C释放进入胞质，和Apaf-1形成凋亡体，激活caspase-3和caspase-9,导致细胞死亡[17]。caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中起到重要作用。其中caspase-3和caspase-9的激活与细胞凋亡密切相关。

实验结果表明，随着ZS10给药浓度的升高，PI3K、AKT、P-AKT以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达均下调，促凋亡蛋白Bax表达上调，同时，其下游的caspase-3和caspase-9表达也上调，Bax/Bcl-2比值升高，说明PI3K/AKT通路在ZS10诱导细胞凋亡中发挥重要作用。

与未使用抑制剂的ZS10组对比，将Z-VAD-FMK与ZS10共同作用于BEL-7402细胞，细胞依旧存在增殖抑制现象，然而，ZS10浓度低于8μmol/L时，对人正常肝细胞未见明显毒性，推测原因可能是Z-VAD-FMK抑制了与caspase相关通路的BEL-7402细胞的凋亡，但是，ZS10可能同时作用于多条信号通路，诱导BEL-7402细胞凋亡。

在本研究中，合成了一种苦参碱衍生物ZS10，该化合物在体外明显抑制肝癌细胞的增殖(Fig 3～5)，基于PI3K/AKT通路诱导BEL-7402细胞凋亡并阻滞S期，为该化合物进一步开发成治疗肝癌的药物提供了实验依据，但ZS10可能对多条信号通路具有明显作用，抑制BEL-7402细胞增殖，诱导细胞凋亡，这需要进一步的研究证实。