黄曲霉毒素B1 对动物危害作用研究

马浩海 袁正宁 刘静 张西锋

（青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

1 黄曲霉毒素简介

1.1 黄曲霉毒素的基本概述

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一类由曲霉菌属的真菌，如黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus Niger）、寄生曲霉（Aspergllu parasiticus）等在生长繁殖过程中产并分泌的一类结构相似次级代谢产物，广泛存在于豆类、花生、玉米等粮食作物以及奶制品、植物油等动植物产品中[1,2]。目前已发现鉴定的种类多达20 余种，包括黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素B2a（AFB2a）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）、黄曲霉毒素M1（AFBM1）、黄曲霉毒素M2（AFM2）、黄曲霉毒素P1（AFP1）、黄曲霉毒素H1、黄曲霉素GM、黄曲霉毒醇等。

1.2 黄曲霉毒素的理化性质

黄曲霉毒素（AFT）是迄今为止发现的最稳定的一种真菌毒素，黄曲霉毒素无色、无味、无嗅，基本结构为二呋喃环和香豆素（氧杂萘邻酮）组成，二呋喃环为基本毒理结构，香豆素则于致癌有关[3]。AF 难溶于水、石油醚、乙醚和己烷，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、氯仿等有机溶剂，分子量为312～346，在弱酸性和中性溶液中稳定，在强酸溶液中稍有分解，在pH 9～10 的强碱性环境中黄曲霉毒素的内酯环被打开毒性消失[4]。因黄曲霉毒素内含大环共轭体系热稳定性极高，分解温度为237～299℃，其中AFB1分解温度为268℃。在波长365nm 的紫外光照下AF 可产生荧光，AFB1、AFB2呈现蓝色荧光，AFG1、AFG2呈现黄绿色荧光。紫外光照还对低浓度黄曲霉毒素具有一定破坏作用[5]。1993 年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）癌症研究机构划定为Ⅰ类天然致癌物，黄曲霉毒素的各种代谢产物的毒性由高到低依次为：AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFM2＞AFG2[6]。

1.3 黄曲霉毒素B1 的生物合成、吸收、代谢

黄曲霉毒素的生物合成较为复杂，在合成过程中包括27 个酶促反应，以丙二酰辅酶A 和乙酰CoA 为底物，在聚酮合酶AflC（polyketide synthase，PKS）的催化下形成聚酮骨架，在经多步脱氢、加氧等修饰过程最终形成高度氧化的黄曲霉毒素[7]。AFB1进入机体后，通过小肠吸收效率多达50%，经门静脉进入肝脏。经Ⅰ相代谢酶细胞色素P450 酶系代谢产生多种产物，如AFM1、AFP1、AFB1-EXO-8，9-环氧化物（AFBO）等，其中AFBO 是介导肝癌发生的主要致癌代谢物[8]。AFBO 经体内Ⅱ相代谢酶代谢而后形成AFB1-GSH，最终以AFB1-硫醇尿酸形式经尿液排出[9]，另一部分没有排除的AFBO 与细胞DNA 形成AFB1-DNA 加合物导致DNA 损伤，诱发癌症[10]。

2 黄曲霉毒素B1 的危害

在农作物的生长收获、运输、贮存及加工过程中均有可能发生黄曲霉毒素的污染。极易污染的农作物包括花生、大米、大豆、食用油等农副产品包括动物饲料，并通过食物链进入动物性食品中，造成肉、蛋、奶等动物性产品的污染，最终威胁人体健康[11]。黄曲霉毒素对畜禽的毒性大小于摄入量、持续时间、动物种类、性别、年龄、健康状态、生长阶段、饲养管理水平等因素相关。在黄曲霉毒素的多种结构中黄曲霉毒素B1的毒性最强，是砒霜的68 倍，氰化钾的10 倍。AFB1对动物的各组织器官均有毒害作用，主要是通过抑制动物机体内蛋白质、酶和有机物的合成及细胞DNA、RNA 的合成干扰，进而干扰各相代谢过程最终造成全身性的伤害。长期摄入AFB1污染的日粮会导致动物免疫、造血和合成分解代谢等功能不同程度的损伤，临床表现主要有：畜禽精神沉郁、采食量下降、消化吸收功能紊乱、多器官出血、生产性能下降、繁殖障碍，生长迟滞，导致癌变等[12]。

2.1 黄曲霉毒素B1 对畜禽机体的毒性作用

黄曲霉毒素B1对机体的毒害作用包括免疫系统、消化系统和生殖系统等多方面，研究表明，经AFB1处理的小鼠肝脏系数明显升高、血清ALT、AST 及造成肝组织氧化损伤，造成肝组织变性、坏死、细胞凋亡[13]。AFB1还可造成小鼠血清白蛋白和总蛋白含量的显著下降，这侧面反映了AFB1影响肝脏内蛋白质合成的能力[14]，此外最新的研究表明AFB1诱导的小鼠肝损伤与线粒体功能障碍有关[15]。家禽连续采食含5mg/kg 的AF 日粮可导致肝脏重量增加，采食量和体重增加（BWG）明显下降[16]。饲喂3ppm 的AFB1可导致家兔肝组织坏死、增重、平均日增重、饲料转化率、营养物质消化系数和氮平衡降低，黄曲霉毒素污染的家兔血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯水平降低，尿素、肌酐和转氨酶浓度升高[17]。这些试验都印证了AFB1对动物肝功能的严重损害。长期摄入AFB1还可导致肾脏损伤和肾脏功能变化[18]，饲喂450μg/kg 的AFB1可导致小鼠肾间质充血、肾小管空泡样变性，肾小管上皮细胞坏死脱落形成管型，血清尿酸、肌酐及尿素氮显著升高[19]。AFB1还可造成神经毒性，研究表明，经AFB1处理的人星形胶质细胞增殖受阻，使线粒体去极化、产生氧化应激，此外，AFB1还降低了转基因斑马鱼胚胎大脑和轴突中gfap、mbp 和olig2 的表达，导致胚胎发育受阻[20]。研究表明，AFB1暴露大鼠可导致氧化应激和DNA 损伤，具体表现为GSH 显著降低、FAS 基因mRNA 表达上调、DNA 片段增加、PHGPx 基因mRNA 表达下调等[21]。在一项关于围产期暴露于AFB1的大鼠研究中，研究发现在断奶（3 周龄）和停止暴露后进入成年（3 月龄）均有不同程度的损害，包括体重减轻，血脂改变、性激素水平降低等[22]，一些研究还证明，较低的出生体重可能增加成年后患肝脏疾病和原发性肝癌（HCC）的风险[23]。体外暴露于50uM AFB1可破坏猪卵母细胞成熟，并诱导表观遗传修饰、氧化应激和凋亡[24]。体外暴露于40μg/L AFB1后，导致着床前牛胚胎发育受阻[25]。有调查显示在不育男性精液样本中发现1.66μg/mL 的AFB1，并且与精子形态异常及精子浓度和活力降低有关[26]。

2.2 黄曲霉毒素B1 对雄性生殖生理的影响

雄性生殖系统由睾丸、附睾及副性腺及生殖管道共同组成。睾丸是主要的雄性生殖器官，其主要负责精子发生和性激素合成分泌[27]。哺乳动物睾丸分实质部分和间质部分，实质部分主要由管周肌样细胞（Myoid cells）、生精细胞（Spermatogenic cells）和睾丸支持细胞（Sertoli cells）组成一个曲细精管。生精细胞从精元干细胞（SSCs）分化形成成熟的功能性单倍体精子，睾丸支持细胞包绕并支持发育中的各级雄性生殖细胞，睾丸支持细胞间的细胞连接与间质中的毛细血管上皮、结缔组织、基膜共同围绕成血-睾屏障（blood testis barrier，BTB）。血生精小管屏障赋予了细胞形态和功能的两极化，创造了有利于精子发育的独特微环境[28]。睾丸间质（Leydig cells）是曲细精管间的结缔组织，包括间质细胞、微血管、神经纤维、淋巴管、巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和结缔组织[29]。睾丸间质细胞是睾丸间质中最主要的成分负责合成分泌睾酮（Testosterone）。

睾丸生理的完整性对于成功产生精子至关重要[30]，但睾丸易受各种外、内源性毒物刺激，进而引起组织结构损伤、精子发生异常，甚至导致雄性生殖功能丧失[31]。AFB1对生殖系统具有较强的毒性作用，其可以穿过BTB，引起睾丸变性和生殖细胞死亡，从而影响精子产量、浓度和运动能力，导致受精过程中激素代谢紊乱。Zamir-Nasta T 等研究表明黄曲霉毒素可导致精母细胞严重的DNA 碎片化，导致p21、p53 等凋亡基因过表达，引起细胞周期蛋白D1 和Cdk4 和ERa表达下调，进而造成细胞周期停滞[32]。Solomon E Owumi 等证明通过连续口服28d 50μg/kg 及5 和10mg/kg AFB1可诱导大鼠下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadal axis）失调，进而导致精子数量和质量的下降[33]。Anas Ashraf 等在给予白来航公鸡更低计量的AFB1（100～400ppb）实验中检测到了相同的变化，此外还检测到睾丸体积减小、坏死，精子发生部分或完全停止，免疫系统遭到严重破坏[34]。Lin LX 等通过给予6 个月大绵羊灌胃1mg/kg AFB1的急性毒性实验中检测到睾丸组织的毒素残留，以及睾丸组织病理学损伤，刺激了睾酮合成相关基因（StAR、3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1）和血清睾酮水平的提高，同时伴有氧化应激和细胞凋亡相关物质的分泌，且该实验观察到暴露于AFB1的绵羊瘤胃微生物菌群失调部分菌群相对丰度降低，且于睾酮合成相关基因呈负相关，发现AFB1可通过改变瘤胃微生物群丰度影响全身循环进而对生殖系统产生毒性作用[35]。

3 黄曲霉毒素B1 的限量标准

在全球黄曲霉毒素的分布呈现一定的季节性和区域性，随着全球化农副产品贸易的发展其分布的区域性越来越不明显[36]。在我国春季温度高、湿度大的南方地区污染较为严重。在世界范围内也是如此，如美国南部地区、澳大利亚、亚洲、拉丁美洲和非洲的一些国家普遍存在。鉴于此世界各国和地区相继推出了黄曲霉毒素在食品及饲料中的限量安全标准[37]。

4 黄曲霉毒素B1 的检测方法

食品和饲料中AFB1检测和分析是确保生产安全和剔除、控制受污染食品及饲料的关键环节，随着仪器设备、技术研发的迭代更新从最初使用的薄层层析法检测黄曲霉毒素至今已经发展出多种方法，其中最常见的方法使用描述如下。

4.1 免疫学技术

免疫学技术主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）、测流免疫层析技术（LFIA）、荧光偏振免疫检测法（FPIA）。ELISA 是一种常用的检测大量食品样本中真菌毒素免疫分析的方法，其原理利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应对样本中的AFB1定性或定量检测方法。该方法具有检出限相对低、特异性强、应用方便等优点。LFIA 是利用ELISA 的原理设计的可对特定霉菌毒素进行视觉定性检测，同时也可使用便携式光度条读取器进行半定量检测。该方法是一种操作简单、快速、低成本的快速一部筛选工具，可用于现场即使霉菌毒素分析[38]。FPIA 是通过测定溶液中荧光团在样品中游离黄曲霉毒素与标记的黄曲霉毒素中的比率间接测定毒素的定量检测[39]。FPIA 需要专用的荧光偏振测定仪，灵敏度较差，但相比于ELISA 和LFIA速度更快，无需分离和洗涤方法，可作为测定粮食中总AFT 含量的初筛方法[40]。

4.2 色谱技术（CTs）

色谱技术是一种广泛应用于化学、医学、工业、农业等学科领域重要的分离分析技术，其分离分析效果好，结果高度精确、灵敏，是目前最广泛应用于食品和饲料样品中霉菌毒素定量分析的技术，其结果的精确、灵敏也用去验证其他方法的有效性[41]。其中薄层层析法（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是分析样品黄曲霉毒素含量的常用方法，目前在国内使用的比较广泛。HPLC 结合紫外（UV）和质谱（MS）检测器以及减少柱填料的UHPLC 检测技术也已经被应用[42]。通过将液相色谱技术与质谱联用，霉菌毒素的分析得到了极大的进步[43]。在所有未使用质谱的色谱技术中，HPLC-FLD 结合有效的提取和净化法方法经常用于真菌毒素的定量分析，尤其是AFs。

4.3 生物传感器和纳米技术

与上述传统技术先比，生物传感器方法已经被证实在食品霉菌毒素检测中具有快速、高灵敏度、便携、实时检测能力和成本低高效益等潜力[44]。例如将金/银纳米颗粒（Au/Ag NPs）、碳基纳米颗粒（CBN）、磁性纳米颗粒（MNPs）、量子点（QDs）等新型纳米材料与传统检测方法结合，开发出高灵敏度、快速的新型检测方法，作为多重分析和纳米跟踪系统的微/纳米传感器技术，作为食品跟踪的微/纳米系统，电化学免疫传感器、微阵列等新型技术都已经被使用[45,46]。

5 黄曲霉毒素B1 的脱毒技术

目前在霉菌毒素污染的治理中，正在实行许多策略来预防或消除污染，预防霉菌毒素的污染是目前公认的首要控制措施。治理措施分为收获前和收获后技术，收获前主要策略包括转基因作物、作物轮作和选择合适的种植时机，收货后可采用包装、干燥、使用防腐剂等，这些方法可以作为预防策略，但在防治污染方面并不奏效，因此开发和应用在收获后受污染食品及饲料的解毒策略及技术变得尤为重要[47]。这就包括物理方法、化学方法及生物学/生物添加剂等方法。

5.1 物理脱毒技术

物理脱毒技术对AFB1污染去除方法主要包括分离，洗涤、溶剂萃取、加热、辐照和吸附等技术。最常用的是加热与γ 射线照射，通过剧烈的加热有效地去除黄曲霉毒素。Arzandeh S 等[48]研究表明，150℃加热12min 可以去除大量AFB1，降解效率达78.4%±4.80。Prado G 等[49]利用Y 射线照射（60Co）照射食品（电离范围在6-60kGy）可破坏AFB1，在10kGy的辐射剂量下花生样品中霉菌生长可被完全抑制，同时在15、20、25 及30kGy 的剂量下足以将AFB1破坏55%～74%。此外在饲料中添加一些吸附剂，可明显减少动物对霉菌毒素的吸收，降低毒性。物理方法去除饲料中的霉菌毒素或防止毒素吸收效果较好，但也存在诸多问题，如物理脱毒可能会影响饲料品质、改变适口性、破坏营养成分，存在安全使用问题。

5.2 化学脱毒技术

化学脱毒法的原理是通过水解、氧化、还原等某种化学反应来破坏霉菌毒素的化学结构来起到脱毒的效果。以证明具有良好脱毒效果的化学试剂种类较多，例如铵盐或氨气、酸性电解水（AcEW）、臭氧、腐殖酸钠等。腐殖酸钠是一种有机化合物具有较强的络合力和螯合力，叶盛群发现在体外模拟动物胃肠道环境中腐殖酸钠对AFB1的具有一定的脱毒效果，且结合稳定[50]。Geovana D 等[51]研究表明，在试验筒仓小麦中通入40～60mg/L 的臭氧30～180min 黄曲霉毒素降解效率高达81%～95%。酸性电解水（AcEW）是将低浓度的NaCl 溶液（＜0.1%）加入水中通过电解制成的消毒剂（曹授俊等，2016）。Qian Zhang 等[52]研究表明AcEW 对天然污染花生中AFB1的清除率高达85%，同时对花生中的营养成分影响较小。氢氧化铵或氨气可改变AF 的化学结构，从而起到脱毒效果[53]。在现代脱毒技术的选择上，化学脱毒法并不是很好的选择，主要原因是化学试剂成本高、加入食品或饲料中可能会破坏某些营养成分，且化学脱毒试剂对不同饲料原材料的反应效果是不同的，某些有机化学试剂还具有腐蚀性，在进行脱毒时还要根据原材料的性质来选择脱毒试剂等问题，同样限制了其在实际生产中的应用。

6 小结

在农作物的生长收获、运输、贮存及加工过程中均能可能发生黄曲霉毒素B1的污染。极易污染的农作物包括花生、大米、大豆、食用油农副产品包括动物饲料，并通过食物链进入动物性食品中，最终威胁人体健康。黄曲霉毒素B1对畜禽的毒性大小于摄入量、持续时间、动物种类、性别、年龄、健康状态、生长阶段、饲养管理水平等密切相关。该文综述了黄曲霉毒素B1的基本概述、理化性质、对畜禽机体和雄性生殖生理的危害作用、以及限量标准和脱毒方法，以期为制定更严格的限量标准、研制更有效的降解途径和方式提供参考。