布鲁氏菌主要外膜蛋白特征及其应用研究进展

王 锐，王占黎，丁海涛，邹 昊

(1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区疾病相关生物标志物重点实验室；3.内蒙古自治区人民医院检验科)

布鲁氏菌属是一种革兰氏阴性、好氧、不运动、无荚膜的杆菌，可引起布鲁氏菌病[1]。布鲁氏菌病是一种人畜共患的慢性传染性疾病，给全球160多个国家和地区带来健康威胁和财务负担[2]，每年全球约有50 000新增病例[3]。在中国，布鲁氏菌病主要发生在北方地区，主要累及人群是青壮年农牧民[4-5]。布鲁氏菌有特殊的细胞膜结构，主要包括脂多糖、外膜蛋白和脂质蛋白等[6]。其主要外膜蛋白(OMP)于1980年代初通过选择性提取技术获得[7]，根据其分子量分为三组，第一组蛋白分子质量在94 kDa，第2组蛋白质量在36～38kDa,同时被称为孔蛋白，第3组蛋白包括分子质量27 kDa ，31～34 kDa和25～27 kDa。外膜蛋白对于维持膜的完整性和选择性渗透至关重要，同时也是布鲁氏菌重要的毒力因子，在布鲁氏菌感染致病过程中起重要作用[8-9]。文献报道，布鲁氏菌的外膜蛋白具有较好的免疫原性，能够刺激机体产生较强的免疫力，可作为布鲁氏菌病诊断性抗原和布鲁氏菌亚单位疫苗的候选物[10]。

本文对目前几种重要的布鲁氏菌外膜蛋白相关研究进展进行综述，以期进一步了解布鲁氏菌外膜蛋白的特性，为研制布鲁氏菌病的诊断试剂及相关疫苗提供参考价值。

1 OMP28

布鲁氏菌外膜蛋白28(OMP28)，也称CP28或BP26，属于第3组外膜蛋白，在流产布鲁氏菌(B.abortus),猪布鲁氏菌(B.suis),绵羊布鲁氏菌(B.ovis),犬布鲁氏菌(B.canis),沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae)和马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)中高度保守 ，是布鲁氏菌病的重要诊断抗原[11]。它还可以有效诱导抗体反应，以预防布鲁氏菌感染[12]。另外，OMP28可用于鉴别布鲁氏菌自然感染动物和疫苗免疫接种动物[13]。Verstreate等[14]采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和生物膜层干涉(BLI)等方法分析了Bp26蛋白与细胞外基质(ECM)蛋白的相互作用。结果发现，OMP28与I型胶原蛋白和玻连蛋白结合，也可与可溶性纤连蛋白结合，但不与层粘连蛋白结合。该研究还使用抗Bp26小鼠血清筛选Bp26抗原表位，发现5个线性表位，其中位于Bp26 C端的表位肽结合能力最强。这项研究有助于理解布鲁氏菌与宿主靶细胞之间的相互作用，同时也有助于未来诊断、疫苗等的开发研究。

Koyuncu等[15]克隆、表达和纯化了布鲁氏菌Omp28的前体Rev1，并基于ELISA技术开发诊断试剂，其灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值均较高，有望用于开发人类布鲁氏菌病诊断试剂盒。另外，将重组外膜蛋白28(rOmp28)直接包被微量滴定板，采用间接ELISA进行血清学检测，其灵敏度和特异性表现良好，证实了该重组蛋白质是开发布鲁氏菌病实验室诊断试剂的合适候选蛋白[16]。

近十年的研究表明，多组分疫苗比单组分亚单位疫苗能够诱导更多的保护性反应[17]。来自不同布鲁氏菌抗原的表位嵌合蛋白所组合成的疫苗，可以实现针对布鲁氏菌感染更有效的免疫应答。有报道从Omp31，OMP28，BLS，DnaK和L7-L12蛋白中选择了5个新的T细胞表位，采用生物信息学技术模拟设计了一种新型多表位疫苗，用以引发对布鲁氏菌病的理想免疫反应,结果表明预防和治疗布鲁氏菌病的理想方法是设计靶向多种蛋白的多抗原表位肽，该疫苗被认为是有潜力的[18]。基于生物信息技术模拟并且评估了该蛋白疫苗的免疫和理化特性，该项技术是一种简便高效的方法。

与固定的外膜蛋白相比，OMP28具有易于检测的优势, 是感染牲畜和人类的一种免疫优势抗原，作为诊断抗原，准确率> 90 %[19]。在动物中使用减毒活疫苗免疫后，血清样品显示OMP28引起的应答比强毒株弱很多[20]，作为潜在的疫苗靶标有很大的可能性，值得进一步研究。

2 OMP2b

布鲁氏菌的Omp2b属于第二组外膜蛋白，并且暴露在细胞表面[21]，是重要的36 kD孔蛋白。Omp2b在外膜蛋白中形成三聚体可参与营养的吸收[22]。在布鲁氏菌表面蛋白抗原中，Omp2a和Omp2b同时也被叫作孔蛋白，在经典布鲁氏菌种中显示出最高的多样性。编码这些蛋白质的基因在布鲁氏菌基因组中紧密相连，方向相反。根据布鲁氏菌属的种类，生物变种或基因型共有85 %～100 %的序列同源性[23]。golshani等[24]分析蛋白质的物理化学参数，指出Omp2b是一种酸性(pH，4.53)且稳定的亲水性蛋白,其二级结构是由7个α螺旋组成，该蛋白质具有正确的拓扑结构，并且在相同大小的天然蛋白质范围内。

关于Omp2b作为诊断试剂研究的相关报道，Vatankhah等[25]基于重组Omp2b抗原，采用ELISA技术开发诊断试剂，检测了布鲁氏菌阴性和接种其他革兰氏阴性菌的小鼠血清，结果其特异性良好。他们后续的研究评估了从不同地区收集的牛血清以及已知的阴性和已知阳性的血清样品，发现Omp2b可以区分布鲁氏菌感染的动物和未感染的动物，其灵敏度为88.5 %，特异性为100 %，准确度为90.8 %。建议重组Omp2b可以作为一种蛋白抗原用于诊断国内布鲁氏菌病动物，同时可以进一步评估检测人类布鲁氏菌病。

Omp2b具有高度免疫原性，其序列高度保守，可诱导B细胞和T细胞介导的免疫反应，被认为是设计新亚单位疫苗的优先抗原[24]。Omp2b可刺激诱导小鼠脾细胞产生的干扰素γ和IL-4水平显著增加[26]。近年来有研究[27]OMP2b和BCSP31组合的多表位免疫学疫苗，经生物信息学统计分析表明OMP2b和BCSP31蛋白的2个T-B结合表位具有免疫原性和免疫反应性，可以诱导T细胞产生IFN-γ，激活体液免疫反应并促进穿孔素和颗粒酶B的产生，这些表位可用为布鲁氏菌病的候选疫苗。也有研究[28]使用多种生物信息学软件来分析Omp2b、p39和BLS的理化性质和空间结构，并预测其T和B细胞的主要表位，结果显示Omp2b有3个线性B细胞显性表位，5个CD8+ T细胞显性表位和3个CD4 + T细胞显性表位，这些表位是理想候选亚单位疫苗的优势选择，同时表位预测可以为构建理想的针对布鲁氏菌病多价表位疫苗提供理论依据。

基于OMP2b免疫优势抗原所设计的新型疫苗制剂，与生物信息学工具所预测的抗原决定簇相辅相成，该项技术无需繁琐、耗时的步骤即可对病原体完整的抗原进行评估分析,这是近年来研究的热点，值得进行进一步探索。

3 OMP19

根据发布的数据，OMP19是一种免疫反应性外膜脂蛋白[29]，而且是最早在大肠杆菌中克隆、表达的布鲁氏菌外膜蛋白[30]。这些重组蛋白也正在接受评估，以期有望用于生产新型疫苗，并在诊断方面有所突破[31-32]，其在血清学诊断方面的潜力也在积极探索。有报道利用克隆、合成并且纯化好的OMP19，采用间接免疫荧光技术检测布鲁氏菌病，其检测抗体的敏感性很高，但特异性中等[33]。Bulashev 等[34]采用重组布鲁氏菌外膜蛋白19、25和31为诊断抗原，收集Omp19免疫的小鼠和兔子血清样品，以及由实验设计和自然感染布鲁氏菌病的151头牛、12头未接种疫苗的小母牛等血清样本，检测重组布鲁氏菌Omp19、Omp25和Omp31的抗原性,结果表明布鲁氏菌Omp19与Omp25和Omp31的结合可被用作针对未接种牛血清学检测的靶抗原。

目前，OMP19在疫苗领域的研究报道较多，其可分为脂化型外膜蛋白19(L-OMP19)与非脂化型外膜蛋白(U-Omp19),U-Omp19被认为是创建新型疫苗制剂最有希望的成分之一[35]。细胞介导的免疫反应被认为是抵抗细胞内病原体(如布鲁氏菌)必不可少的因素[36]。用表达四种布鲁氏菌(BLS、PrpA、Omp19和SOD)蛋白的组合疫苗,鼠伤寒沙门氏菌作为载体递送，可使组合疫苗的免疫原性有效保留，表明其在保护牲畜免受布鲁氏菌侵袭方面具有潜在的用途[37]。有关肠上皮细胞对抗原的捕获和加工能力的研究对于开发新的口服给药系统非常重要，高效的口服抗原输送系统必须抵抗胃和肠道蛋白酶降解作用，充分有效地输送抗原。已经证明U-Omp19是一种具有自佐剂能力的蛋白[38]，其可通过树突状细胞(DC)内部的溶酶体蛋白酶抑制抗原的消化，从而延长抗原的半衰期，增强抗原向T细胞的呈递[39]，并促进黏膜和全身性抗原特异性免疫应答。细菌蛋白酶抑制剂U-Omp19可以与上皮屏障相互作用[40]，抑制肠细胞(刷状边界和细胞内蛋白酶)对抗原蛋白水解的敏感性，但不会改变肠细胞的完整性和上皮屏障的通透性。U-Omp19可抑制胃肠道主要蛋白酶的作用，从而保护口服疫苗在传递过程中抗原免受消化，同时还可增加免疫反应[41]。因此，被提议作为亚单位疫苗制剂的候选成分。

对于OMP19蛋白用于诊断的研究，众多研究结果说法不一，还需进一步探索。亚单位疫苗，例如重组蛋白，是潜在的疫苗候选者，因为其无毒、更安全、经济、纯度高，利于批量生产。OMP19有潜在的疫苗研究价值，但还需要深入研究。

4 其他外膜蛋白

研究人员对OMP10、OMP16、OMP25等外膜蛋白在体外进行原核表达，并基于ELISA技术作为诊断性抗原，系统分析了这些蛋白在诊断人类、牛和山羊布鲁氏菌病血清诊断中的作用[42]。结果表明，Omp16与嗜肺军团菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌有交叉反应性，Omp16、Omp25、Omp10 在诊断人类布鲁氏菌病的准确度分别为93.49 %、88.76 %和93.49 %，诊断牛的准确度分别为78.47 %、74.31 %和75.69 %，诊断山羊的准确度分别为83.33 %、85.00 %和80.00 %。Omp16-IL2融合蛋白的重组乳球菌作为口服乳球菌疫苗，为评价成本效益、更安全、简单的药品试点生产提供了一种有吸引力的新方法，也为其他异源蛋白抗原提供可行的传递模式[43]。与其他常用的减毒活疫苗相比，该重组疫苗的免疫原性和保护性还需要进一步探索。Gupta 等[44]建立了一种由布鲁氏菌Omp25和L7/L12组成的二价重组疫苗，单独和联合免疫小鼠后，其IgG滴度增强，主要介导Th2免疫反应，结果表明，Omp25和L7/L12组合使用作为二价疫苗更有优势。关于布鲁氏菌外膜蛋白作为诊断和疫苗的可能性还有很大的研究空间，其成本低、安全性能好、方便快捷等优势特点有待进一步挖掘。

5 小结

现行的布鲁氏菌病血清学诊断方法主要基于脂多糖抗原(LPS)、全菌蛋白、粗制外膜蛋白、盐析蛋白、酚盐蛋白等菌体来源的天然抗原，会与革兰氏阴性细菌(如小肠结肠炎耶尔森菌O：9、大肠杆菌、沙门氏菌等)产生交叉反应，可能会给出假阳性结果。研制快速、准确的诊断试剂是早发现、早治疗布鲁氏菌病的关键，且安全有效的疫苗对布鲁氏菌病的预防也必不可少，而外膜蛋白研究的兴起为布鲁氏菌病的诊断及疫苗研制提供了更大的可能性。对外膜蛋白的深入研究不仅有助于了解布鲁氏菌与宿主的相互作用, 而且对建立敏感性和特异性高的诊断方法及制备新型亚单位疫苗具有重要的意义。