网络药理学在乌头属中药药效物质基础、作用机制及毒性研究中的应用进展

杨 梅，迪丽美合日·迪力夏提，赵翡翠,2*

(1.新疆医科大学第四临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

毛茛科(Ranuculaceae)乌头属(AconitumL.)植物是重要的药用植物资源。目前我国约有200种乌头属植物，大多分布在西南横断山区南部，其中可供药用的乌头属植物约有36种。常用乌头属中药主要有乌头(川乌)、北乌头(草乌)、黄花乌头(关白附)、短柄乌头(雪上一枝蒿)和甘青乌头[1]。乌头属中药作为有毒中药，虽然其药性峻猛，使用不慎极易对人体造成伤害，但因其在治疗肿瘤、风湿病、坐骨神经痛等疑难杂症方面效果显著[2-3]，受到研究者的关注。当前在推动中医药现代化和国际化的大背景下，如何全面系统地解析乌头属中药药效的科学内涵是中医药工作者亟需研究的课题。

网络药理学是基于基因、蛋白等不同水平对生物学事件进行系统研究的方法学体系，其关注整体性和系统性的特点与中医药学的整体观念相吻合，有助于探索中药多成分、多靶点、多途径作用机制[4-5]。近年来，许多研究者将网络药理学运用到乌头属中药的研究当中，取得了一定的成果。作者对网络药理学常用的数据库、分析平台及软件进行总结，对网络药理学在乌头属中药药效物质基础，抗肿瘤、抗炎、镇痛等作用机制以及毒性研究中的应用情况进行综述，并对网络药理学在乌头属中药研究应用中面临的挑战及未来展望进行总结，以期为乌头属中药深入研究提供一定参考。

1 网络药理学方法概述

网络药理学一词最先是由Hopkins[6]提出。网络药理学是借助大数据技术，利用开放数据库筛选中药的化学成分、化学成分和特定疾病的靶点信息，然后构建“药物-成分-靶点-信号通路-疾病”多维可视化网络模型，进而在细胞、分子和生物整体层面上对网络信号节点进行多级分析，确定关键节点，从而预测中药治疗疾病的活性成分、作用靶点以及可能参与调节的信号通路，揭示其潜在作用机制。可见，在运用网络药理学构建多维复杂网络的过程中涉及到了药物作用网络、疾病作用网络以及相互作用网络。

2 网络药理学常用的数据库、分析平台及软件

收集中药活性成分的数据库：中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmp.php)，中药综合数据库(TCM-ID，http://www.megabionet.org/tcmid/)，中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。

垂钓成分靶点数据库：中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmp.php)，中药整合药理学平台(TCMIP，http://www.tcmip.cn/)，靶标预测在线平台(SwissTargetPrediction，http://swisstargetprediction.ch/)。

疾病靶点筛选数据库：治疗靶点数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)，疾病基因数据库(DisGeNET，https://www.disgenet.org/home/)，基因名片数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)，基因表达数据库(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，在线孟德尔人类遗传数据库(OMIM，https://omim.org/)，Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)。

蛋白质互作分析数据库：蛋白质相互作用数据库(String，https://string-db.org/)。

GO富集分析及KEGG信号通路富集分析数据库：生物信息数据库(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)，MetaScape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

网络构建、可视化软件：Cytoscape软件(https://cytoscape.org/)，R语言(https://www.r-project.org/)，Omicshare平台(http://www.omicshare.com/)等。

3 网络药理学在乌头属中药研究中的应用

3.1 药效物质基础方面

3.1.1 乌头属单味中药

中药药效物质基础是中药治疗某种疾病全部药效成分总和。中药药效物质基础的研究方法包括成分“敲出/敲入”方法[7]、中药谱效关联方法[8]、“等效成分群”发现技术[9]等。随着网络药理学的发展，越来越多的学者将网络药理学运用到中药药效物质基础的研究当中。龚胜男等[10]运用网络药理学技术预测出新南五味子酸B、肉质雪胆皂苷Ⅰ、次乌头碱、水黄皮素、3-去氧乌头碱、多根乌头碱、德尔妥因、异塔拉定、惰碱、去氧穿心莲内酯是附子治疗糖尿病的主要药效成分。Chen等[11]基于网络药理学发现，14-去氧-11,12-二去氢穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、刺桐碱、仙人球毒碱、去甲乌药碱等11个成分是附子治疗变应性鼻炎的药效物质。王越华等[12]运用网络药理学技术筛选出次乌头碱、关附素A、亚油酸、β-谷甾醇、2，4-乙基胆甾醇等5个成分，其可能是关白附水煎液的抗肿瘤药效物质。

3.1.2 乌头属中药复方

中药复方由2种或2种以上中药组成，所含成分复杂，如何厘清中药复方的化学组成及药效物质基础一直是中医药工作者探索的方向。随着网络药理学的出现，中药复方药效物质基础研究有了新的手段和有效参考[13-16]。郭秋岩[17]运用网络药理学技术研究乌头汤缓解神经病理性疼痛的药效物质基础，从数据库中检索到162个乌头汤成分，从中筛选出类药性较好的41个活性成分，结合分子对接技术及表面等离子共振技术最终明确芍药苷和甘草苷可能是乌头汤缓解神经病理性疼痛的关键药效物质。毛霞[18]基于全基因组表达谱和网络药理学分析，预测出乌头所含的塔拉定和白芍所含的芍药苷是乌头汤缓解类风湿关节炎寒证的药效物质。

3.1.3 乌头属中药药对

中药药对是2种中药的固定搭配，是中医药独特的组方形式，能够起到协同增效、相制减毒等作用。现代学者运用网络药理学技术挖掘乌头属经典药对的药效物质基础，取得了一定的进展。黄菁等[19]基于TCMSP检索去重整理得到“桂枝-附子”药对27个活性成分和667个成分靶点，通过疾病靶点数据库检索到类风湿关节炎靶点920个，构建了“桂枝附子配伍-化学成分-靶点-类风湿关节炎”网络，通过网络分析，计算出度值较高的化合物，预测出“桂枝-附子”药对治疗类风湿关节炎的药效物质可能为β-谷甾醇、二氢槲皮素、儿茶素、石防风素。

可见，网络药理学的运用丰富了乌头属中药药效物质基础研究手段。研究者通过数据库检索出乌头属中药的化学成分，通过设定口服生物利用度(OB)和类药性(DL)的数值筛选活性成分，找到活性成分对应的靶点，进而筛选出乌头属中药治疗某种疾病的关键靶点；借助Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，进而预测出乌头属中药治疗某种疾病的药效物质基础。面对乌头属中药成分复杂且其化学成分研究尚不深入等现状，运用网络药理学能够为乌头属中药药效物质基础研究提供帮助。

3.2 作用机制方面

3.2.1 抗肿瘤作用机制

目前，有关网络药理学应用于乌头属中药抗肿瘤作用机制研究方面的报道较少。有研究者[20]基于网络药理学发现，薏苡附子散中苯甲酰乌头原碱、去甲乌药碱、薏苡酯、薏苡素等14个活性成分通过作用多个靶点对信号转导、内分泌调节、神经调节等多条信号通路发挥作用，从而提示薏苡附子散除具有强心和治疗胸痹急痛作用外，还可能具有抗癌等作用。莫嘉浩等[21]运用网络药理学技术研究薏苡附子败酱散抗肝细胞癌的作用机制，发现豆甾醇、谷甾醇是薏苡附子败酱散抗肝细胞癌的活性成分，其作用靶点可能是TP53、HSP90AA1等，所涉及到的信号通路可能是白细胞介素(IL)-17通路、糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路、乙型肝炎病毒(HBV)通路等。

3.2.2 抗炎作用机制

网络药理学对乌头属中药机制研究多集中在抗炎作用机制方面。郑世超等[22]运用网络药理学技术研究川乌的抗炎作用机制，发现趋化因子介导的白细胞趋化作用及前列腺素代谢过程可能与川乌抗炎作用密切相关。骆帝等[23]运用网络药理学技术发现，酪氨酸激酶受体2的信号转导作用、过氧化物酶增殖激活受体的协同激活作用及白细胞介素1受体信号转导都与乌头汤治疗骨关节炎有关。Ye等[24]运用网络药理学和UPLC-QTOF-MS/MS联合技术发现，乌头能减轻尿酸单钠(MSU)晶体诱导的关节肿胀、减轻滑膜组织损伤、下调血清炎性因子表达，MAPK14、MMP9、PTGS2等可能是乌头抗炎的作用靶点。

3.2.3 镇痛作用机制

乌头汤是具有镇痛作用的传统复方之一，《金匮要略》记载“病历节不可屈伸, 疼痛, 乌头汤主之”。郑春松等[25]运用网络药理学技术模拟出乌头汤镇痛的分子作用机制，发现乌头汤可能通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路等多种途径发挥镇痛作用。

3.2.4 治疗COVID-19患者脓毒性综合征作用机制

Liu等[26]探究了对脓毒性综合征COVID-19患者具有临床疗效的参附黄方剂(全方由人参、附子、大黄3味药组成)的作用机制；运用网络药理学技术鉴定出49个活性成分及69个潜在靶点，包括GSK3b、ESR1、PPARG、PTGS2、AKR1B10和MAPK14，相关信号通路涉及Toll样受体、MAPK、PPAR、VEGF、NOD样受体和NF-κB信号通路；将网络分析与实验验证相结合，最终发现参附黄方剂可能通过显著抑制炎症损伤、改善巨噬细胞的吞噬作用、上调免疫基因的表达及良好的抗凝作用等治疗COVID-19患者脓毒性综合征。

3.2.5 治疗慢性心功能不全作用机制

黄嘉滢等[27]运用网络药理学结合实验验证的方法探索强心饮(全方由附子、淫羊藿2味药组成)治疗慢性心功能不全的作用机制；通过TCMSP、OMIM、GeneCards分别获得附子-淫羊藿药对的活性成分28个、对应靶点209个、疾病靶点1 296个、药物与疾病共同基因靶点94个；MetaScape 富集分析发现，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Akt可能是附子-淫羊藿药对治疗慢性心功能不全的重要靶点，并通过实验验证了此预测结果。许洪彬等[28]基于网络药理学探讨了真武汤(全方由茯苓、白芍、白术、生姜、附子等5味药组成)治疗慢性心力衰竭的作用机制；初步明确了真武汤治疗慢性心力衰竭的药效物质为乌头碱、3β-乙酰氧基苍术酮、山奈酚、芍药苷、豆甾醇、β-谷甾醇等，作用靶点为白介素6、内皮型一氧化氮合酶、血红素加氧酶1、前列腺素G/H合酶2、过氧化氢酶等，主要作用通路为环鸟苷酸-蛋白激酶G信号通路、肾素分泌、钙信号通路等。Chen等[29]运用网络药理学技术发现，磷酸肌醇3-激酶γ、胰岛素受体和葡萄糖激酶是四逆汤抗心力衰竭的作用靶点。

此外，基于网络药理学研究发现：附子-肉桂药对通过补体和凝血级联、花生四烯酸代谢和PI3K/Akt信号通路发挥治疗心脑血管疾病的多重作用机制[30]；附子-白芍药对能够通过PTGS1、PGR调节去甲肾上腺素、5-羟色胺和γ-氨基丁酸等脑内神经递质过程发挥抗抑郁作用[31]。

近十余年来，针对乌头属中药的研究主要集中在化学成分发现、附子生物碱及合理用药、生物碱检测、高乌头及高乌甲素、方剂配伍及减毒等方面[32]。然而，伴随着网络药理学的发展，乌头属中药的研究方向也悄然发生改变。通过运用网络药理学技术，研究者发现乌头属中药通过调控NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路等多种途径发挥抗肿瘤、抗炎、镇痛、治疗慢性心功能不全等作用，使得乌头属中药的研究更加多元化，由单一的传统的针对化学成分的研究转向多种作用机制研究。

3.3 毒性方面

毒性是中药的一种性能，对毒性的理解，广义上认为中药的偏性就是毒性，中药正是利用其偏性方能驱邪治病，因此，毒性具有普遍性；而狭义上则认为毒性就是中药对机体产生的不良反应，这与现代药物毒理学的概念相似。

乌头属中药为有毒药材，如使用不当可出现恶心、呕吐、头晕眼花、口舌及全身发麻、四肢逆冷、休克等症状，严重者可导致死亡[33]。现代研究表明，乌头属中药可导致心脏毒性、神经毒性、生殖毒性及胚胎毒性[34-35]，但有关其毒性机制方面的报道较少。

何健等[33]利用CTD数据库检索出附子致心脏不良反应相关靶点，将附子中所含的主要毒性成分，即乌头碱(aconitine)、新乌头碱 (mesaconitine)、次乌头碱(hypaconitine)作为目标成分，通过GeneCards数据库检索出目标成分的作用靶点，随即运用Cytoscape软件构建附子毒性成分致心脏不良反应相关基因靶点网络，进行生物进程富集分析，最终预测出附子的心脏毒性作用机制可能是通过作用于编码缝隙连接蛋白1(GJA1)、缝隙连接蛋白5(GJA5)、钠通道蛋白(SCN5A)的相关基因调控心脏缝隙连接蛋白、钠离子通道蛋白的表达，影响心肌细胞除极、细胞间信息传递及物质交换，导致心脏节律、结构和功能的异常。宋臻臻[36]选取四逆汤(全方由附子、干姜和甘草3味药组成)中的6-姜酚(干姜活性成分)、甘草酸(甘草活性成分)、乌头碱(附子活性成分)进行配伍减毒机制探索，利用PharmMapper等数据库分别筛选出6-姜酚、甘草酸、乌头碱对应的靶点，利用CTD、GeneCards、DisGeNET数据库检索获得心脏毒性相关靶标信息，进而获得乌头碱心脏毒性作用靶点；分别将6-姜酚活性靶点、甘草酸活性靶点与乌头碱心脏毒性作用靶点取交集，得到MAPK1、MAP2K1、AKT1、MAPK8、MAPK14、SRC等76个6-姜酚拮抗乌头碱心脏毒性作用靶标以及MAPK、GRB2、CDC42、EGFR、GSK3B、SRC等64个甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用靶标；经过KEGG富集分析，最终预测出PI3K/Akt信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路等可能是6-姜酚拮抗乌头碱心脏毒性的重要通路，PI3K/Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路等可能是甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性的重要通路。

可见，网络药理学技术在乌头属中药毒性机制、配伍减毒机制及炮制减毒机制等研究中均得到了应用，取得了一定的成果，为乌头属中药临床使用安全有效提供了有力的理论支撑。

4 展望

网络药理学的应用，突破了传统乌头属中药研究中“单成分-单靶点-单通路”的研究思路，与中医药整体观念相吻合。采用网络药理学技术对乌头属中药进行多靶点研究设计，将乌头属中药与疾病靶点有效地衔接起来，有利于发现乌头属中药药效物质基础，探索乌头属中药作用机制，促进乌头属中药毒性、炮制机制等相关研究。但作为一种新型研究模式，网络药理学还存在一些不足：一是数据库的准确性、全面性有待提高。由于网络药理学的预测完全借助大数据技术，而有些数据库收录的数据信息本身存在偏倚，且中医药的专属数据库较少以及乌头属中药相关数据信息较少，这些都会影响到预测结果的准确性；二是需要合适的验证方法对网络药理学的预测结果加以证实。乌头属中药自身成分复杂，且影响其活性成分的因素也很多，如种植环境、采收时间、药物在人体内的代谢转化过程等，这些影响因素决定了采用大数据技术构建的乌头属中药“成分-靶点”网络仍处于雏形阶段，需要研究者继续探索，通过计算机、中医药学、实验等多学科融合找到更加精准的验证方法对网络药理学得到的预测结果加以证实。

虽然目前网络药理学运用于乌头属中药研究仍处于起步阶段，但这一新的研究模式必将为乌头属中药研究提供新的支持与途径，推动乌头属中药研究向纵深发展。