一株产纤维素酶降香内生真菌的分离鉴定及产酶活性检测

高 原，王 琢，孙诗雨，王金鹤，王 鑫

(哈尔滨商业大学药学院 细胞与分子生物学研究所，黑龙江 哈尔滨 150076)

降香檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)为豆科黄檀属乔木，主要生长在海南、广东等地。降香檀可供药用，其干燥芯材称为降香。降香具备散瘀、理气、活血止血、定痛等功效，也可以减缓由于气滞血瘀造成的跌打伤痛、胸胁疼痛和脘腹胀痛，还具有医治脾胃不和、腹痛呕吐等功效[1-2]。降香属于国家二级保护植物，其分布受到地域和生长环境的限制，生长慢，资源日益短缺。

从植物的内生真菌中可获得很多次生代谢产物，在植物提取、次生代谢产物研发方面具有较大的开发应用价值[3-5]；而产纤维素酶内生真菌在降香及其它中药材活性成分的提取方面具有应用价值。鉴于此，作者从降香中分离纯化获得一株产纤维素酶内生真菌，测定其产酶活性，并对其进行分子生物学鉴定。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜降香树枝，采于广州市老果农实验基地，经鉴定为蝶形花科、黄檀属降香(DalbergiaodoriferaT.Chen)；营养肉汤、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，北京奥博星生物科技有限责任公司。

PCR试剂盒，天根生物；DNA提取试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其它试剂均为分析纯。

电热鼓风干燥箱、恒温培养振荡器、高速台式离心机、BP-9082型精密恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；金属浴，杭州博日科技有限公司；PCR仪，Eppendorf；凝胶电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，北京五洲东方科技发展有限公司；SX-700型高压灭菌锅，TOMY；BSA6202S-CW型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；pH计，Satorius。

1.2 方法

1.2.1 降香内生真菌的分离纯化

通过植物组织表面消毒法从降香树皮中分离获得降香内生真菌。

采用尖端菌丝挑取法，将降香内生真菌接种于PDA培养皿上，置于28 ℃恒温生化箱中培养7 d后反复纯化3次。

1.2.2 产纤维素酶降香内生真菌的筛选

待菌落长出后，通过灭菌枪头挑取直径约0.5 cm菌饼，接种于纤维素刚果红培养皿上，做3个平行实验，置于28 ℃恒温生化箱中培养3～4 d，观察菌落形态，测量透明圈的直径，筛选产纤维素酶降香内生真菌。

1.2.3 产纤维素酶降香内生真菌的产酶活性检测

1.2.3.1 粗酶液的制备

吕布有野心，他杀董卓，也是想单干。故而，投奔袁术、袁绍，这两家世伐大族，皆不能容他，袁绍还想偷袭杀了他。当时群雄并起，他即与张邈、陈宫等合伙，竖立自己旗帜，想要分天下一杯羹。他去夺兖州，曹操说，这是我的地盘，你干嘛来夺，吕布说：“汉家城池，诸人有份，偏尔合得。”这可是说了大实话。当时众雄，岂非都在瓜分汉家天下？

挑取高产纤维素酶的降香内生真菌菌丝，转接至200 mL PDB液体培养基中，调整摇床温度为30 ℃，培养7～10 d，无菌纱布过滤获得培养液，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取物，旋转蒸发至浸膏，备用。

1.2.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准溶液：称取100 mg葡萄糖(85 ℃烘干至恒重)于容量瓶中，加入蒸馏水待完全溶解后定容至100 mL，置于4 ℃冰箱中贮存。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色剂：称取185 g酒石酸钾钠于装有500 mL热水的容量瓶中，待溶解完全后依次加入6.3 g DNS、262 mL 2 mol·L-1NaOH溶液、5 g苯酚、5 g亚硫酸钠，完全溶解并恢复至室温后，用蒸馏水定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中[6]。

葡萄糖标准曲线的绘制：配制浓度(mg·mL-1)分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6的葡萄糖标准溶液，吸取1 mL于试管中，加入1.5 mL DNS显色剂，摇匀；沸水浴精准加热5 min后立刻取出，降至室温后，用蒸馏水定容至20 mL，测定540 nm处吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线[7]。

1.2.3.3 酶活力的测定

酶活力定义：底物为羧甲基纤维素钠，pH值为6，反应条件为50 ℃水浴恒温加热30 min，定义每30 min催化羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖所需的纤维素酶量为一个酶活力单位，用IU·mL-1表示[12]。

羧甲基纤维素酶活力(X，IU·mL-1)按下式计算：

式中：m为依据标准曲线方程计算的葡萄糖含量，mg；n为酶液稀释倍数；V为酶液体积，mL；t为培养时间，min；5.56为1 mg葡萄糖的μmol数，1000/180=5.56。

1.2.4 产纤维素酶降香内生真菌的分子生物学鉴定

采用CTAB法提取降香内生真菌DNA，对降香内生真菌JXP2-2目的基因 ITS rDNA片段扩增并测序。上游引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，下游引物为ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。采用琼脂糖凝胶电泳检测JXP2-2目的片段的PCR扩增产物；委托生工生物工程(上海)股份有限公司测定PCR扩增产物序列；利用Mega 5.0软件构建系统发育树，并对降香内生真菌JXP2-2进行分类鉴定，参数设置：邻接树方法(neighbor-joining)，最大概似法(maximum composite likelihood)模型，自展值为1 000。

2 结果与讨论

2.1 分离纯化

从保存完好的降香内生真菌培养皿中挑取5株具有不同形态、大小、颜色的菌落进行纯化。利用纤维素刚果红培养皿完成初筛，获得一株产纤维素酶效果较好的降香内生真菌JXP2-2，其菌落形态如图1所示。

图1 菌株JXP2-2的菌落形态

菌株JXP2-2经发酵培养产生的透明圈直径为2.20 cm，透明圈直径与其菌落直径的比值(D/d)为2.75。

2.2 产酶活性

按1.2.3.2方法绘制葡萄糖标准曲线，得到线性回归方程：y=0.1314x+0.0051，R2=0.9993。取粗酶液，稀释100倍，按1.2.3.3方法测定纤维素酶活力，结果如图2所示。

从图2可以看出，随着培养时间的延长，菌株JXP2-2粗酶液的酶活力逐渐升高，4.5 d时达到最高，为84.50 IU·mL-1；继续延长培养时间，酶活力反而下降，第4.5 d～第5.5 d，酶活力下降显著，从84.50 IU·mL-1降至73.32 IU·mL-1，第5.5 d～第6.5 d，酶活力降幅趋缓，从73.32 IU·mL-1降至71.06 IU·mL-1，第6.5 d～第7.5 d，酶活力基本稳定。随着培养时间的延长，对照组的酶活力也逐渐升高，4.5 d时达到最高，为80.65 IU·mL-1；继续延长培养时间，酶活力基本呈直线下降。

图2 菌株JXP2-2粗酶液酶活力变化曲线

2.3 分子生物学鉴定

2.3.1 JXP2-2 ITS序列PCR扩增

采用CTAB法提取产纤维素酶降香内生真菌JXP2-2的基因组DNA，使用ITS1、ITS4引物对内生真菌JXP2-2 ITS序列进行PCR扩增，以基因组DNA为模板扩增获得ITS产物，扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，共536个碱基。

2.3.2 系统发育树构建

在GenBank数据库中，对PCR扩增得到的菌株JXP2-2的ITS-DNA基因序列进行BLAST比对[13]，发现该序列与尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)KX347475的相似度高达99%，并利用Mega 5.0软件进行分析，建立系统发育树，如图3所示。

图3 基于ITS基因构建的菌株JXP2-2系统发育树

从图3可以看出，菌株JXP2-2与尖孢炭疽菌聚为一枝，表现出较近的亲缘关系。菌株JXP2-2与尖孢炭疽菌遗传距离最近，碱基相似度为99%，但是从系统发育的角度来讲亲缘关系程度达到95%，初步鉴定菌株JXP2-2为尖孢炭疽菌。

3 结论

采用植物组织表面消毒法分离获得降香内生真菌，使用纤维素刚果红培养皿筛选获得一株产纤维素酶的降香内生真菌。初步鉴定该菌株属尖孢炭疽菌，具有较高的产纤维素酶活性。该研究在节约降香资源、保护植物生长环境、辅助提取中药活性成分等方面具有重要意义，为构建高产纤维素酶工程菌提供了参考。