结直肠癌原位移植造模技术研究进展

曹巍巍，郭修田

(上海中医药大学附属市中医医院肛肠科，上海 200071)

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的一种消化道恶性肿瘤，在世界范围内影响男性和女性最常见肿瘤中居第3位[1-3]。每年有超过100万新病例报告，大约60万患者死于这种疾病[4]。而在我国，CRC发病率和病死率也在不断上升。根据《中国结直肠癌诊疗规范(2020年版)》[5]2018年中国癌症统计报告显示，我国CRC发病率、病死率在全部恶性肿瘤中分别位居第3及第5位，新发病例37.6万，死亡病例19.1万。

近年来，针对CRC的动物模型受到了广泛关注。近5年来，关于CRC小鼠造模的综述[6-9]也逐渐增多，CRC生物复杂性激发了更合适的研究设计的发展[10]。啮齿类动物模型[11-12]具有许多重要的属性，它们与人类的许多相同特征已被证明对理解CRC的许多复杂分子方面非常重要，它们也是开发新的化疗药物的宝贵工具[13-14]。这使得实验室小鼠成为肿瘤学研究中最具吸引力的实体之一。目前常规使用的CRC动物模型分为自发性模型、诱发性模型、移植性模型以及转基因模型。现对CRC移植模型中原位移植的最新研究进展进行阐述。

1 原位移植造模优势

以往的小鼠肿瘤模型均为异种移植瘤异位模型，为新型原位肿瘤模型的发展奠定了基础[15]。这些异种异位移植模型传统上是通过将人结肠癌细胞皮下植入裸鼠。在这个模型中，形成的肿瘤位于外部，因此它更容易完整地与组织分离，可以更加准确地测量肿瘤的生长情况和大小。然而，传统的皮下肿瘤模型对大肠癌的研究并不理想，制作一个异位模型很容易，但它不能模拟人类的疾病过程[16]。因为肿瘤的解剖位置在皮下，且皮下转移不存在，所以该模型不适合研究自发转移过程[17-19]。大肠癌原位小鼠模型以癌细胞在自然位置生长为特征，高保真地复制了人类疾病过程，能更准确地预测肿瘤治疗的临床结果[20]。因此，原位移植模型是一种比较容易建立且肿瘤生物学特性与在体肿瘤较为一致的模型，是进行CRC生物学研究和肿瘤药物筛选研究的理想模型[21]。

2 原位移植造模方法

原位异种移植模型的制备方法有多种，按技术方法可分为开放手术造模、灌肠造模、经肛门低剂量电凝造模以及内镜微创造模四种。

2.1 开放手术造模 Zhu等[22]于2020年3月将来自于美国加州大学圣地亚哥分校外科肿瘤科(UCSD)1例术前未接受任何化疗或放疗的患者的CRC样本移植在裸鼠皮下。肿瘤长大后再次采集，移植在表达绿色荧光蛋白的裸鼠皮下传代两代，提取最终表达绿色荧光蛋白的小鼠直肠癌细胞。麻醉非表达绿色荧光蛋白的裸鼠后，在腹部正中皮肤切开约1 cm，在盲肠上缝合一个5 mm×5 mm×5 mm的肿瘤碎片，使用6-0尼龙线缝合切口，建立原位移植的CRC模型。该模型的淋巴转移率与远处器官转移率文中并未统计，但肿瘤发生率为100%。Hu等[23]在传统的开放手术原位造模法的基础上改良了肿瘤碎片的种植方式。传统方式是用手术缝合线将1 mm×1 mm的肿瘤碎片缝合于直肠黏膜损伤区域，而改良模型是用黏合剂(氰基丙烯酸酯)代替手术缝合线，1 mm×1 mm的肿瘤碎片黏附于直肠黏膜损伤区域。对比传统缝合方式，改良模型在手术耗时、小鼠成活率以及肿瘤大小方面有明显优势。

2.2 灌肠造模 Kishimoto等[24]将小鼠CRC细胞系CT26和人CRC细胞系HCT-116在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养，造模过程是先通过化学破坏直肠黏膜屏障。将小鼠麻醉后，通过肛门将一根聚乙烯导管插入直肠腔，用6 ml PBS冲洗直肠腔，以清除肠道内容物。将牵开器插入肛门直肠区域，扩张直肠腔，然后用4%乙酸溶液浸泡直肠黏膜2 min，然后再次用6 ml PBS冲洗。在直肠黏膜屏障破裂后，立即将CT26-GFP细胞注入50 μl 基底胶，用一根针将其灌注到距肛门4 mm的直肠黏膜表面。在注入癌细胞后，立即用塑料胶带将肛门密封，将牵开器夹在直肠内，以防止细胞渗漏。手术总时间约为每只小鼠15 min，没有发生与醋酸治疗和癌细胞植入相关的并发症或死亡。最终，肿瘤发生率为100%，肠系膜下淋巴结转移率为90.9%，主动脉旁淋巴结转移率为54.5%，肺转移率为91.8%，肝转移率为9%。

2.3 经肛门低剂量电凝造模 Bhullar等[25]将CRL-2639、CRL-2638、HT-29、LS-174T肿瘤细胞系植入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。麻醉后将小鼠仰卧放置。特别设计的可拆卸单电极的外护套由柔软的橡胶制成，尖端光滑。首先把直肠引入橡胶护套，辅以水溶性凝胶润滑，从而避免对结肠造成伤害。然后，将软金属单极电极穿过先前放置的外层橡胶护套，确保电极的非创伤性圆端刚好伸出外橡胶套为电极提供绝缘，将软夹具应用于小鼠尾尖并连接到Bovie机器。电流过低时不能造成黏膜损伤，过高则会导致穿孔，通过尝试不同的Bovie设置，最终选择最佳的5 W设置进行研究。在预设的单个或3个点电凝结肠黏膜，每个点之间至少间隔5 mm的距离，从距离肛门口2 cm开始。去电极后，将一根24 Fr TeflonⅠ/Ⅴ套管插入直肠灌注肿瘤细胞。结果显示，肿瘤发生率CRL-2638为100%，CRL-2639为92%，LS-174T为100%，HT-29为58%；淋巴转移率CRL-2638为100%，CRL-2639为50%，LS-174T为83.3%，HT-29为33.3%；肝转移率CRL-2638为41.7%，CRL-2639为0%，LS-174T为83.3%，HT-29为0%。

2.4 内镜微创造模 Hite等[26]将HT-29细胞通过显微镜下注射在SCID小鼠直肠黏膜下。具体造模方式为：将小鼠麻醉后，用润滑的钝头钳扩张肛管，暴露远端肛门和直肠黏膜。使用奥林巴斯解剖显微镜汉密尔顿微升注射器把肿瘤细胞注射到直肠远端黏膜下层、肛管以上1～2 mm处。结果显示，小鼠直肠原位肿瘤发生率为100%，肝转移率为60%，肺转移率为56%，淋巴转移率文中未统计。Chen 等[27]描述了一种使用内镜微创手术的新型CRC原位移植造模法，将CT26细胞系原位移植在BALB/C小鼠直肠黏膜下，MC38细胞系原位移植在C57BL/6J小鼠直肠黏膜下，植入细胞数分别为104、105和106个，各实验组均取14 d观察期，以观察各组的肿瘤发生率及转移率，结果显示CT26各组肿瘤发生率均为100%，淋巴转移率分别为75%(104个细胞)、100%(105个细胞)和50%(106个细胞)，肝转移率分别为25%(104个细胞)、50%(105个细胞)和50%(106个细胞)；MC38肿瘤发生率发表为0%(104个细胞)、25%(105个细胞)和50%(106个细胞)，淋巴转移率和肝转移率各组均为0%。

3 四种原位移植造模方法优缺点

Zhu等[22]在裸鼠盲肠上进行的原位移植造模是在裸鼠腹部切开皮肤，找到盲肠，在盲肠上缝合肿瘤细胞碎片，再缝合切口，所以造模的定位很准确，可以根据实验需求自主选择肿瘤细胞移植点位，且肿瘤移植成功率和成瘤率很高，这是开放手术造模相较于其他造模方式的显著优势。Hu等[23]发表的改良模型用黏合剂(氰基丙烯酸酯)代替手术缝合线，在手术耗时、小鼠成活率以及肿瘤大小方面有明显优势。但是同样，开放手术带来的开放性创口容易造成小鼠术后感染，增加模型病死率，且需要缝合切口，对手术操作本身有一定的要求。

Kishimoto等[24]介绍的灌肠模型没有开放性创口，操作较为便捷且成瘤率高，而且淋巴转移率和其他器官转移率都较高。据我们所知，这是第一个可以可靠地提供真正的原位直肠癌在黏膜组织中生长，并随后引起自发淋巴结和肺转移的模型，这很容易被GFP荧光高灵敏度检测到。该模型可用于研究肿瘤的早期生长或评估可能增强或抑制早期CRC生长的腔内因素(膳食化合物、胆汁酸、肠道菌群等)。但是灌肠模型不能根据实验要求精准选取肿瘤细胞种植点位，这是该模型的明显缺点。

Bhullar等[25]提出的经肛门低剂量电凝造模法结合了开放手术造模法和灌肠造模法的优势，在设定合适的电流量后，将电极经小鼠肛门到达直肠黏膜的目标点位，造成黏膜损伤后退出肛门，再使用灌肠法使得肿瘤细胞在黏膜下目标点位种植。这种造模法既没有开放创口，也可以精确到几个点位，是目前比较新的一种造模方式，具有其独特的优势。但是该造模法对于设备有一定的要求，且调试电极过程中会造成小鼠的意外死亡。

Hite等[26]介绍的显微镜下注射模型是截至目前最安全、最可复制、最成功的具有原发肿瘤生长和自发远处转移特征的原位CRC小鼠模型。而且，该模型在主观上是最快建立的，最容易学习，技术上最容易操作，对动物的压力较小。肿瘤成瘤率和肝、肺转移率都是实验组中最高的，淋巴转移率实验未涉及。Chen等[27]介绍的内镜微创造模法是目前比较先进的原位CRC造模法，是利用内镜观察并选取直肠目标注射点位，后引入柔性注射导管，使注射针轻轻穿过结肠黏膜，使其斜面朝向管腔。再由第2名研究员注射肿瘤细胞悬液，看到黏膜轻微抬起(“阳性抬升标志”)则为注射成功。该造模法肿瘤种植成功率高，操作简单，淋巴转移率和远处转移率都比较高，是目前比较先进的一种造模方式[28]，且效果较好，但是对实验器材要求较高，造模成本很高，普及率较低。

4 结 语

目前主流的几种原位CRC小鼠造模方式都各有其优势和不足之处。传统的开放手术种植点位精准，操作简便，器材易得，但是对小鼠创伤较大，病死率和感染率较高。最新的几种非手术经肛门的造模方式相比于传统开放手术和灌肠造模法有了一定的改良，在大大降低了小鼠病死率和感染率的同时提高了种植点位的精准度，但是对设备有较高的要求，较难进行推广和普及。相信在科学技术的不断升级和推动下，新的方法将会引入到CRC的造模之中，为临床和科研提供更有利的数据支持。