顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法分析杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分

曾 桥，唐文洁，温谨瑞，孙 敏,3，边文文，张亚锋，谷文军，吕生华 ，段 洁,

（1.陕西科技大学轻工科学与工程学院，陕西西安 710021；2.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；3.陕西农产品加工技术研究院，陕西西安 710021；4.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048；5.西安市食品药品检验所，陕西西安 710054；6.陕西朴道茶业股份有限公司，陕西咸阳 713700）

杜仲为杜仲科杜仲属植物，别名扯丝皮、思仲、丝棉皮、玉丝皮，是我国特有经济树种，多分布在长江中游和南部各省[1-2]，近年来，随着不断的引种和驯化，分布范围更加广泛。传统上杜仲主要以皮入药，《中国药典》记载其有补肝肾，强筋骨，安胎等功效，用于治疗肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安等[3]。研究表明，杜仲叶含有和杜仲皮类似的活性成分，包括多糖、黄酮、多酚、氨基酸、京尼平苷、京尼平苷酸和桃叶珊瑚苷等[4-9]，具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、抑菌、抗疲劳、抗肿瘤等[8-11]多种保健功能。杜仲叶属于可再生资源，分布广泛，产量巨大，不仅有望在临床上部分替代杜仲皮，还可广泛应用于功能食品的开发，具有较大的发展潜力。

目前，杜仲叶食品的开发以杜仲叶茶为主，多以杜仲树的嫩稍或叶为原料，采用传统绿茶和红茶工艺制作而成，产品普遍具有青草的涩味，口感较差，因而未得到市场的广泛认可。茯砖茶为黑茶类后发酵茶，常以黑毛茶为原料，经原料筛选、渥堆、气蒸、压制成型、发花干燥和陈化等一系列复杂工艺加工而成，发花是茯砖茶加工过程中最为关键的工序，其不仅赋予茯砖茶金花普茂的特征，还有效地改善了其风味和口感，大大提升了产品的品质[12]，而经过陈化，茯砖茶茶汤香气更加纯正，口感愈发的醇和，因此，茯砖茶还有“越陈越香”的美誉[13]。基于此，本研究前期以杜仲叶茶为原料，采用茯砖茶加工工艺制备杜仲叶茯砖茶，进一步提升了杜仲叶茶的品质。香气是茶叶的重要品质特征，原料和加工工艺是决定茶叶香气特征的主要因素[14]，顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）具有简单、快速、灵敏度高、选择性好的优点，其与气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spec trometry, GC-MS）联用已被广泛应用于绿茶、红茶、和黑茶等香气成分的检测，从而为茶叶的品质化学研究提供依据[15]，但目前尚未见应用该方法研究杜仲叶茯砖茶香气成分的报道。因此，为识别杜仲叶茯砖茶香气特征以及探究加工过程中香气成分的变化规律，本研究应用HS-SPMEGC-MS法对杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分进行检测，并对杜仲叶茯砖茶不同加工阶段样本挥发性成分进行对比分析，从而为杜仲叶茯砖茶加工过程中香气成分的调控和品质提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲叶茶 略阳县嘉灵特种茶开发中心。

GCMS-TQ8050 NX三重四极杆型气相色谱质谱联用仪 日本SHIMADZU公司；AOC-6000自动进样器 日本SHIMADZU公司；ARR11-DVB/CWR120/20-P5萃取头 瑞士CTC Analytics。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备和采集 以同一批次杜仲叶茶为原料在陕西朴道茶业股份有限公司经筛选、渥堆、气蒸、压制成型、发花干燥和陈化等工艺制成，其中，发花过程持续时间为25 d。分别于加工过程中的原料筛选，渥堆，气蒸与压制成型（即发花第0 d），发花第8、25 d及陈化1年等6个阶段取样，依次编号为S0，S1……S5，所有样本取样后立即破碎，混合均匀，冷冻干燥后储存于-80 ℃下待进行HS-SPME/GC-MS分析。

1.2.2 样品处理 称取适量样品进行液氮研磨，取磨碎均匀样品2 g（精确至0.01 g），置于20 mL SPME萃取瓶中，用密封垫封口，随后放入AOC-6000自动进样器中，进行自动固相微萃取。

1.2.3 SPME条件 100 ℃恒温炉先平衡20 min，使茶叶挥发性组分挥发，然后将固相微萃取针插入萃取瓶中，边平衡边萃取60 min，随后将萃取头插入到GC进样口，在250 ℃的条件下解吸2 min。为防止样品间的污染，萃取头于进样前在300 ℃老化5 min，萃取结束后在300 ℃老化20 min。

1.2.4 GC-MS/MS条件 色谱柱为Inter Cap Wax石英毛细管柱（30 cm×0.25 mm×0.25 μm）；载气为He （99.999%），流速1 mL/min；进样模式：不分流；不分流进样时间：1 min；进样口温度：250 ℃；升温条件：50 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至220 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至240 ℃保持5 min；电子轰击离子源（EI），温度为230 ℃，接口温度：250 ℃；电子能量70 eV，采集模式：Q3 Scan；质量扫描范围35～500 m/z[16]。

1.3 数据处理

依据所获取的总离子流色谱图质谱信息，经NIST2017标准谱库检索定性鉴定出成分，取SI（Similar Index）＞85为有效数据。依据峰面积归一化法得到各成分在杜仲叶茯砖茶挥发性组分中的相对含量[17-18]，结果为3次平行实验的平均值，数据用±s表示，利用Excel软件进行数据处理。采用MetaboAnalyst 5.0进行主成分分析（principle component analysis，PCA）和聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA），进一步应用SIMCA 14.1进行偏最小二乘法分析（PLS-DA）和变量重要性（variable importance on projection scores，VIP＞1.0）分析，对筛选出的VIP＞1.0的标志差异性香气成分利用MetaboAnalyst 5.0进行热图分析。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC-MS检测结果及挥发性成分分析

由表1可以看出，通过HS-SPME-GC-MS在杜仲叶茯砖茶各不同阶段样本中共筛选鉴定出152种挥发性成分，包括13种酸类，20种酯类，18种酮类，22种醇类，17种醛类，24种烷类，15种芳香族类，7种呋喃类，10种烯烃类和6种其他类，其中相对含量较高的为棕榈酸、月桂酸、丙三醇、3-呋喃甲醇、二氢猕猴桃内酯、棕榈酸甲酯、3-呋喃甲基乙酸酯、亚麻酸甲酯、β-紫罗兰酮和2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、植酮等。在原料，渥堆，发花第0 d，发花第8、25 d及陈化1年等6个不同阶段样本中分别检测出84、84、83、70、79和88种挥发性成分，上述各不同阶段样本共有的挥发性成分为37种，占所有鉴定出挥发性成分的24.34%，说明不同阶段样本挥发性成分差异较大，各不同加工阶段样本挥发性成分种类数和含量见图1。与李俊杰等[19]以传统黑毛茶为原料加工的茯砖茶相比，杜仲叶茯砖茶中大多数挥发性成分种类不同，说明杜仲叶茯砖茶有其独特的香气特征。

表 1 挥发性成分定性及相对含量分析Table 1 Qualitative analysis and relative content of volatile components

由图1a可以看出，在原料、渥堆、气蒸过程中挥发性成分种数变化不大，而发花过程中挥发性成分种数减少较为明显，其中发花8 d较发花0 d挥发性成分种数减少15.66%，随着发花时间的延长，杜仲叶茯砖茶中挥发性成分种数逐步增加，尤其经过1年的陈化，茶样中挥发性成分的数量明显回升，且在所有样本中达到最高。由图1b可以发现，酸类（19.06%～30.59%）、酯类（15.58%～21.87%）、酮类（11.84%～14.30%）和醇类（10.52%～20.07%）为各样本中总体含量较高的挥发性成分，醛类（4.02%～6.28%）、烷类（5.17%～6.34%）、芳香族类（0.93%～5.76%）和呋喃类（2.85%～5.65%）含量次之，烯烃类（1.51%～2.89%）和其他类（1.65%～3.04%）含量最低。

图 1 不同加工阶段样本挥发性成分种类数（a）及其含量（b）Fig.1 The types (a) and content (b) of volatile components in different stages

酸类化合物是各样本中相对含量最高的挥发性成分，在鉴定出的13种酸类化合物中，所有样本共有的酸类化合物有6种，分别为棕榈酸、十五烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、乙酸和18-壬酸。棕榈酸在各茶样中的相对含量介于9.86%～17.79%，是主要的挥发性酸，虽然在发花后期略有下降，但在陈化过程中明显回升。棕榈酸本身不具有任何的香气，但能降解生成壬醛、庚醛等香气物质，对香气的影响不容忽视[20]。其次含量较高的为具有酸涩味的乙酸[21]（0.98%～7.93%），微有月桂油香味的月桂酸[22]（1.28%～2.77%）和具有微弱的蜡香和奶香味的肉豆蔻酸[22]（1.04%～1.74%），其余成分在所有样本中含量均较低。和S0相比，肉豆蔻酸、棕榈酸和月桂酸在S5中相对含量分别增加了67.31%、75.96%和63.91%。同时，通过1年的陈化，新产生了具有类似蜂蜜甜香的苯乙酸[23]，而乙酸以及略带辛辣的刺激油味的丙酸[24]在加工过程中含量下降明显。上述挥发性成分相对含量的变化对于提升杜仲叶茯砖茶蜡香、乳香和甜香等有益，同时有助于减弱茶汤的刺激性，从而改善杜仲叶茯砖茶的风味。在发花阶段，呈淡脂肪和椰子香气的壬酸[25]，具有蜡、奶酪、脂肪香的辛酸[22]和十一酸相对含量下降幅度均较大，但壬酸和辛酸在陈化阶段上升明显。此外，在陈化阶段，棕榈酸、苯乙酸、肉豆蔻酸和无或微有似安息香或苯甲醛气味的苯甲酸[26]相对含量上升幅度均较大，说明陈化对于调整酸类化合物的含量和组成，进而促进杜仲叶茯砖茶良好的风味的形成具有较为重要的作用。

续表 1

续表 1

酯类挥发性成分主要具有花果香、木香、蜡香和乳香等风味[20]，对杜仲叶茯砖茶香气有着较为重要的贡献。杜仲叶茯砖茶加工过程中鉴定出的酯类化合物共有20种，各不同阶段样本共有的挥发性成分包括具有脂肪、蜡质气味的棕榈酸甲酯[25]、呈香豆素及麝香样气息二氢猕猴桃内酯[25]、无气味的亚麻酸甲酯[17]、反式-9-十八碳烯酸甲酯、3-呋喃甲基乙酸酯、（Z）-18-十八碳-烯内酯等6种，占总数的30.00%，说明各不同阶段样本酯类化合物差异较为明显。酯类挥发性成分相对含量在S0～S4阶段呈下降趋势，进入陈化阶段则明显上升，而传统以黑毛茶为原料加工茯砖茶过程中，酯类挥发性成分含量呈上升趋势[19]，说明酯类代谢变化规律与原料有较大关系。二氢猕猴桃内酯（3.54%～8.82%）为杜仲叶茯砖茶中含量最高的酯类挥发性成分，有研究表明，二氢猕猴桃内酯是普洱茶木香的主要成分[27]，其次为3-呋喃甲基乙酸酯（2.14%～5.62%）、棕榈酸甲酯（1.80%～4.19%）、亚麻酸甲酯（1.39%～2.61%）和（Z）-18-十八碳-烯内酯（0.76%～1.30%）。此外，具有果香和奶油香气的棕榈酸乙酯[28]的相对含量虽然在S0～S4各阶段样本中含量较低，但经过长期陈化后，其在陈化样本S5中的含量较原料S0增加1300%，上述挥发性成分对于赋予茶叶木香、花果香和乳香有重要贡献。S5样本中酯类的丰富度均较其他阶段样本高，其中包含的相对含量较高的成分为棕榈酸甲酯（4.19%）、二氢猕猴桃内酯（3.54%）、亚麻酸甲酯（2.61%）、3-呋喃甲基乙酸酯（2.14%）、反式-9-十八碳烯酸甲酯（1.29%）、（Z）-18-十八烷烯内酯（1.07%）、棕榈酸乙酯（0.98%）以及呈蜡香和甜香的亚麻酸乙酯[29]（0.84%）等。总体来看，酯类化合物种类在S0～S4阶段变化不大，但是在陈化阶段上升明显，和S0相比，S5中酯类化合物种数较原料增加了45.45%。此外，陈化新产生了乙酸异丙烯酯、γ-戊内酯、亚麻酸乙酯、亚油酸乙酯等多种挥发性成分，不仅大幅增加了茶样中酯类化合物的丰富度，而且提高了酯类化合物总相对含量，对于杜仲叶茯砖茶特有花果香和乳香的形成具有重要作用。

酮类化合物主要赋予杜仲叶茯砖茶木香、花香、烤香和果香等，由于具有较低的阈值[30]，因此对杜仲叶茯砖茶风味贡献较大。由表1可以看出，整个加工过程中共鉴定出酮类化合物18种，各不同阶段茶样中共有的酮类化合物为3种，分别为具有紫罗兰香、水果香和木香的β-紫罗兰酮[19]，呈草药味和木质香气的植酮[25]和2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮，仅占酮类化合物总数量的16.67 %，说明加工过程中各不同阶段样本酮类化合物种类差异较为明显。由图1b可以看出，酮类挥发性成分总相对含量在整个加工过程中变化不大，其在发花25 d（S4）样本中总的相对含量最高，陈化（S5）样本中含量最低，二者相差2.46%。S5样本中主要的酮类挥发性成分为β-紫罗兰酮（2.02%）、呈浓郁的焦糖香气，同时具有烤面包、焦糖麦芽香味的菊苣酮[31]（1.62%）、植酮（2.23%）以及2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（3.22%）等，其余酮类化合物成分相对含量均低于0.94%。在传统茯砖茶发花过程中，β-紫罗兰酮仅在发花后期被检测到，因而部分学者推测其为“菌花香”的关键组分[19]，而β-紫罗兰酮在杜仲叶茯砖茶原料中就具有较高的含量，且在加工过程中呈逐步下降趋势，至陈化阶段基本保持稳定，说明原料不同，“菌花香”物质的代谢规律和组成可能有一定的差异。

醇类化合物具有特殊的花香、果香和木香[20]，在鉴定出的22种醇类化合物中，共有的香气成分有4种，其中以3-呋喃甲醇和具有愉悦的果香、花香、脂香、芳香的植物醇[25]含量较高，3-呋喃甲醇在加工过程中呈逐步下降趋势，而植物醇先上升后下降。研究表明，传统以黑毛茶加工茯砖茶的过程中，醇类物质呈下降趋势[25]，而在杜仲叶茯砖茶加工过程中，其种数和相对含量总体上均呈先下降后上升的趋势，且在发花后期和陈化阶段相对含量明显高于其他阶段样本，分别达20.07%和17.15%，这主要是由于在发花中、后期及陈化阶段，新产生了相对含量较高（4.76%～11.50%）的丙三醇。虽然丙三醇为杜仲叶茯砖茶发花和陈化阶段相对含量最高的醇类化合物，但由于其无气味，因而对杜仲叶茯砖茶香气无贡献。芳樟醇在原料、渥堆和气蒸样本中均未检测到，但在发花中、后期及陈化阶段相对含量较高，这与传统以黑毛茶为原料加工的茯砖茶的结果类似，其在加工过程中的含量变化与冠突散囊菌有密切关系。有研究表明，芳樟醇为普洱茶及六堡茶中醇类物质的主体[32]，同时，芳樟醇及其氧化物还被认为是茯砖茶“菌花香”的关键组分，是茶叶中主要的赋香成分，由于其具有较好的柑橘、铃兰香、花香、青香及木香[25]，因而在发花后期以及陈化阶段含量的上升有助于提高杜仲叶茯砖茶的品质。此外，雪松醇是普洱茶或陈茶中木香和陈香的主要成分[33]，其在杜仲叶茯砖茶加工过程中呈下降趋势，尤其在陈化阶段下降明显，最终在S5样本中未被检测到，其相对含量的下降对茶叶风味的影响还有待于进一步研究。异植物醇为原料经渥堆后新产生的挥发性成分，呈细腻的干叶、茶香样气息，并略带焦糖的甜气[17]，在后续加工过程中较为稳定。苯甲醇有令人愉快的水果香气和强烈的熏烤味[25]，其在S0～S4阶段呈下降趋势，然而经过1年的陈化，其相对含量明显上升，最终在S5中的含量为0.91%，它与芳樟醇、植物醇、异植物醇等为构成杜仲叶茯砖茶菌香、花香、果香和木香的主要来源之一。

醛类物质多呈果香、花香、橘香、清香和草药香等[25]，香气特征良好。由图1b可以看出，醛类物质在杜仲叶茯砖茶中相对含量不高，但由于其阈值较低[30]，因而对茶叶的风味有较为重要的影响。在S0～S5样本中共鉴定出17种醛类物质，丙醛、3-糠醛、5-羟甲基糠醛和乙醛为所有样本中共有的挥发性醛类。3-糠醛为相对含量最高的醛类物质，且随着加工过程的进行，其相对含量呈逐步上升趋势，具有咖啡香、烤甜香的5-羟甲基糠醛[34]含量仅次于3-糠醛，随着加工过程的进行逐渐降低，但其在S5样本中含量仍较高，达0.77%，较低浓度具有令人愉快的水果香味的乙醛[35]相对含量在加工过程中先下降，发花过程中逐渐上升，后在陈化阶段略有下降，上述三种成分合计占S5样本中总醛含量的83.40%，为影响杜仲叶茯砖茶产品香气的重要醛类物质。此外，S5样本中还包含有橙子及玫瑰香气的壬醛[25]以及具有紫罗兰和黄瓜香等清香味的反-2-顺-6-壬二烯醛[36]，这些香气成分和其他成分有助于赋予陈化后的杜仲叶茯砖茶特有的果香、花香和甜香等。2-己烯醛和青叶醛呈青草味[25,37]，其中2-己烯醛在加工过程中下降较为明显，青叶醛主要在发花阶段产生，但经陈化处理后在S5样本中未被检测到，上述挥发性成分的下降对于改善杜仲叶茯砖茶的青辛味，促进纯正香气的形成有一定作用。

烷类阈值较高，几乎不呈现香气，但却对茶的香气构造起着间接的重要作用[20]。S0～S5样本中共鉴定出24种烷类挥发性成分，其中各茶样中共有的烷类化合物仅4种，包括正二十烷、3-甲基-5-丙基壬烷、六甲基环三硅氧烷和十八甲基环九硅氧烷。S4样本中烷类化合物种类最少，同时各不同阶段茶样中烷类挥发性成分总的相对含量随着加工过程的进行总体呈逐步下降趋势，发花中后期和陈化阶段较为稳定。S0～S5样本中共鉴定出15种芳香族类挥发性成分，总相对含量在加工过程中呈先下降，发花后期上升，陈化过程中又明显下降的趋势，9-亚甲基-9H-芴和（Z）-正丁烯基苯酞为所有茶样中共有的芳香族类化合物。部分成分在加工前期和中期含量较高，而在发花后期和陈化阶段未检测到，包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，以及具有焦糖香味、蜜饯的水果香气，其稀溶液具有轻微的草莓芬芳的甲基麦芽酚[38]以及2,4-二叔丁基苯酚等。检测到的部分呋喃类化合物如具有坚果和肉香型香料味的2-乙酰基呋喃[39]等具有较好的香气特征，但除2,3-二氢苯并呋喃相对含量较高外，其他均较低，对茶叶品质影响较小。杜仲叶茯砖茶加工过程中鉴定出的烯烃类化合物共有10种，其中各不同阶段茶样中共有仅2种，分别为苊烯和呈清香且具有刺激性气味的新植二烯[40]，二者在杜仲叶茯砖茶加工过程中的相对含量均呈下降趋势。总体来看，烯烃类化合物在杜仲叶茯砖茶样本中相对含量较低，在S5样本中，烯烃类化合物总的相对含量为2.52%，其中含量较高的为3,4,4-三甲基-2-己烯（1.05%）、新植二烯（0.70%）等。除前述各类挥发性成分外，杜仲叶茯砖茶各样本中还鉴定到吡咯、吡啶和胺等化合物，除2-乙酰基吡咯含量较高外，其他成分在S5中的相对含量均较低，对杜仲叶茯砖茶香气的贡献较小。

总体来看，杜仲叶茯砖茶挥发性成分在加工过程中的组成和含量发生了明显的变化，从相对含量来看，酸类、酯类、酮类和醇类为主要的挥发性成分，可能是杜仲叶茯砖茶特有香味物质的主要来源，这与传统以黑毛茶为原料加工的茯砖茶以醇类、酯类、醛类物质为主要香味物质来源有一定的不同[19]。此外，醛类化合物虽然相对含量较低，但由于气味阈值普遍较低，因而对杜仲叶茯砖茶总体香气有较为重要的潜在作用。原料、渥堆、气蒸三个阶段的样本差异相对较小，在鉴定出的152种挥发性成分中，有45种在S0、S1和S2中均未检测到，三个阶段共有的有65种，占总数的72.37%，说明在S0～S2阶段，挥发性成分结构组成变化相对较小。而发花是杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分种类数和相对含量变化最大的阶段，这可能是由于发花过程中剧烈的微生物活动造成的。由于在发花阶段以冠突散囊菌为主的曲霉属为绝对优势菌群，微生物多样性较低[41-42]，这可能是导致此阶段样本中挥发性成分种类最少的重要原因，但尚需进一步证实。通过发花降低了乙酸、丙酸、异丁醛、苯酚等具有不良气味挥发性成分的含量，新产生了芳樟醇等具有“菌花香”的成分，从而有助于提升茶叶香气品质。陈化有助于茯砖茶内部化学成分的进一步转化，从而使得茶汤香气更加宜人[43]，经过1年陈化处理，杜仲叶茯砖茶挥发性成分种类较发花结束增加11.39%，大大提高了挥发性成分的丰富度。其中，与发花结束相比，酯类成分增加最为明显，其种类数和相对含量分别增加77.78%和31.51%，这可能是赋予杜仲叶茯砖茶良好的花果香、木香、蜡香和乳香等风味的关键。

2.2 主成分分析

对杜仲叶茯砖茶各不同阶段样本挥发性成分进行主成分分析，可直观地反映各样本挥发性成分的差异。从图2a可以看出，杜仲叶茯砖茶不同加工阶段挥发性成分PCA图中PC1为72.05%，PC2为16.43%，累计贡献率为88.48%，表明PC1、PC2的总贡献率包含了杜仲叶茯砖茶样本的大部分信息，较好的反映了不同茶样之间挥发性成分差异的影响因素。S1和S2样本在PCA图中呈现一定的分离状态，说明气蒸过程中的高温对杜仲叶茯砖茶中的挥发性成分有较大影响，但二者间的距离较其他样本近，说明渥堆和气蒸压制成型样本之间差异性相对其他样本较小，二者与S0样本间距离较大，则说明渥堆对杜仲叶茯砖茶挥发性成分变化影响较大。此外，发花和陈化阶段各样本在PCA图上和其他样本呈现明显的分离，说明茶样挥发性成分在此过程中发生了很大的变化，风味物质能够得到良好的分离，进而说明发花和陈化是改善杜仲叶茯砖茶香气的主要过程，这与传统以黑毛茶为原料加工茯砖茶的结论类似[12]。在PCA分析基础上，进一步进行HCA分析，结果如图2b，其中S1和S2聚到第Ⅰ类群，S0聚到第Ⅱ类群，S3聚到第Ⅲ类群，S4和S5聚到第Ⅳ类群，说明在该工艺下杜仲叶茯砖茶不同阶段样本的香气特征差别较大，这与PCA分析结果一致。

图 2 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶挥发性成分主成分分析（a）和聚类分析（b）Fig.2 Principal component analysis (a) and cluster analysis (b) of volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea

2.3 差异代谢物筛选分析

基于不同加工阶段杜仲叶茯砖茶挥发性成分的相对含量建立的PLS-DA模型如图3所示，可以看出，该模型将不同茶样进行了有效分离，其拟合参数为R2X=0.942，R2Y=0.995，Q2=0.986，说明该模型具有较强的累积解释度和预测能力，且稳定性良好，可用于不同加工阶段杜仲叶茯砖茶样的判别分析。

PLS-DA变量重要性因子（VIP）能够量化各个变量对分类的贡献度，从而筛选出重要的特征物质，一般认为VIP＞1表示该变量具有重要作用，且VIP值越大，说明该变量在不同加工阶段杜仲叶茯砖茶样本间的差异越显著[44]。由图4可以看出，VIP值大于1的挥发性成分共有64种，涵盖了酮类、醇类、酯类、醛类、烷类等，包括5-乙基香茅烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、1-己烯-3-醇、苯甲酸、十四烷、顺-3,4-二甲基-2-戊烯、3,5-二羟基-2-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、3-氨基苯酚、5-羟基-3-甲基-1-茚酮、2-烯丙基呋喃、α-法呢烯、反式-3-己烯-1-醇、2-甲基二十六（碳）烷、2-吡咯甲醛、环十五内酯等，而在VIP值大于1的挥发性成分中相对含量较高的为月桂酸、18-壬酸、植酮、植物醇、（Z）-18-十八烷烯内酯、邻苯二甲酸二丁酯、法尼基丙酮、2-烯丙基呋喃等，上述64种VIP大于1.0的标志差异性挥发性成分可作为区分不同加工阶段杜仲叶茯砖茶的标志物。

为直观展示64个标志差异性挥发性成分在不同加工阶段杜仲叶茯砖茶样本间的分布情况，进一步对其进行聚类热图（HCA）分析，如图5所示。可以发现，陈化1年后的杜仲叶茯砖茶样本S5中特有的标志差异性挥发性成分较少，而S0和S4最多。其中，3,7,11,15-四甲基-2-十六烯、乙醇、5-甲基吲哚、正三十二烷、1-二十三（碳）烯、（E,E）-2,4-己二烯醛、对甲苯异氰酸酯、2-辛基-1-癸醇、2-十一烯醛、邻苯二甲酸二甲酯和十二醇等标志差异性挥发性成分在S0中的含量最高。其中，3,7,11,15-四甲基-2-十六烯仅在S0和S5中被检测出，且二者差异极显著（P＜0.01），5-甲基吲哚仅在S0和S4中被检测出，且二者差异极显著（P＜0.01），其余成分除乙醇外，均仅在S0中被检测出，上述成分可以作为区分原料与其他阶段样本的候选标记物进行深入研究。3-氨基苯酚、3,5-二羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、顺-3,4-二甲基-2-戊烯、环十五内酯、5-羟基-3-甲基-1-茚酮等标志差异性挥发性成分仅在S1中被检测到，可以作为区分渥堆过程与其他加工阶段的候选标记物。渥堆是茯砖茶加工中较为重要的环节，通过渥堆调节茶叶水分，为冠突散囊菌的萌发提供适宜条件，同时，在渥堆过程中还发生了一系列生理生化反应，从而促进茶叶品质的提升[45]，因此，进一步探讨3-氨基苯酚等挥发性成分与渥堆过程中杜仲叶茶品质的内在关系，为精准调控渥堆工艺有一定的现实意义。苯甲酸、5-乙基香茅烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、1-己烯-3-醇等标志差异性挥发性成分在S2中含量最高，苯甲酸仅在S2和S5中被检测出，且二者差异显著（P＜0.05），其余成分仅在S2中被检测到，可以作为区分气蒸与其他加工阶段的候选标记物。植酮、2-吡咯甲醛和2-羟基环十五酮等标志差异性挥发性成分在S3中含量最高，其中，除植酮在所有样本中均被检测到，其余成分仅在S3中被检测到。发花是形成茯砖茶金花普茂以及独特菌香风味和醇和口感的关键步骤[25]，而S3是在杜仲叶茯砖茶金花大量产生的关键时间点所取样本，因此，对发花过程中植酮、2-吡咯甲醛和2-羟基环十五酮的含量与冠突散囊菌数量进行相关性研究，有助于对发花质量进行判断分析。7,11-二甲基-3-亚甲基1,6,10-十二碳三烯、2-（十四氧基）乙醇、4-羟基-5-甲基-3-丙基-2-己酮、羟基丙酮、5,6-环氧-3-羟基-β-紫罗兰酮、丁位己内酯、乙琥胺、对丙基茴香醚、β-石竹烯、苯酞、4,4-二甲基-2-环戊烯-1-酮、甲基环戊烷等仅在S4中被检测出，因此，上述成分可以作为表征发花结束的候选标记物进行进一步研究。尤其，5,6-环氧-3-羟基-β-紫罗兰酮、乙琥胺、对丙基茴香醚相对含量均在0.9%以上，作为表征发花结束的候选标记物具有更高的可靠性。

图 3 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶挥发性成分PLS-DA分析得分图Fig.3 Score plot of PLS-DA based on volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea

图 4 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶挥发性成分的VIP值图Fig.4 VIP plot of volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea

3 结论

茯砖茶是我国独有且真正意义上有微生物参与的后发酵茶，由于其特殊的加工工艺，导致挥发性化合物的组分和种类发生了深刻的变化，从而可在一定程度上提升杜仲叶茶的香气品质。本文应用 HSSPME-GC-MS技术对杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分进行测定，共筛选鉴定出152种挥发性化合物，包括酸类、酯类、酮类、醇类、醛类、烷类、烯烃类、芳香族类、呋喃类和其他，其中，酸类、酯类、酮类和醇类为相对含量较高的挥发性成分，可能是杜仲叶茯砖茶特有香气物质的主要来源。杜仲叶茯砖茶各不同加工阶段样本在PCA图上呈明显分离状态，说明加工过程中挥发性成分发生了较大的变化。经过渥堆、气蒸、发花和陈化处理，酸类、醇类、酮类和酯类等挥发性成分组成和结构发生了明显的变化，丙酸、乙酸、2-己烯醛等部分具有刺激性、青辛气不良气味挥发性成分的含量下降明显，而芳樟醇、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸乙酯、菊苣酮、乙醛等部分具有菌花香、木香、花果香、乳香等的挥发性成分新产生或相对含量上升。在最终产品S5茶样中，棕榈酸甲酯、二氢猕猴桃内酯、月桂酸、植酮、β-紫罗兰酮等为相对含量较高的呈香挥发性成分，可能为构成杜仲叶茯砖茶风味特征的主体物质。基于VIP值筛选出64种标志差异性挥发性成分，部分成分在特定的加工阶段的相对含量与其他阶段存在明显差异，可以作为区分杜仲叶茯砖茶不同加工阶段的候选标记物，后续应进一步对此进行深入研究，这为杜仲叶茯砖茶香气特征的形成、识别和加工过程中香气成分的调控提供了依据和参考。

图 5 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶差异挥发性成分聚类热图Fig.5 Cluster heat map of difference volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea