猪鞭虫基于ITS 基因PCR 诊断

黄志坚

（福建省三明市绿色食品发展中心，福建三明 365000）

猪鞭虫（Trichuris suis）又称猪毛尾线虫，属于无尾感器纲（Aphasmidea）毛尾目（Trichurata）毛尾科（Trichuridea）毛尾属（Trichuris），虫体前部细长，后部粗短，形似马鞭，故也有毛首线虫或鞭虫之称[1-5]。鞭虫虫体呈乳白色，前部为食道部，约占细长前部的3/5，内含由1 串单细胞围绕的食道；后部为体部，约占短粗后部的2/5，内有生殖器和肠管。雌虫体长40～50mm，尾直、末端呈圆形；雄虫体长30～40mm，尾部呈螺旋状卷曲[6]。虫卵腰鼓状，两端有塞，卵壳厚，呈棕黄色。猪鞭虫的生活史不需要中间宿主，虫卵或幼虫在外界发育到具有感染性后直接感染终末宿主。

猪鞭虫病的感染度较强、较普遍，四季均有发生，但虫卵在夏季的孵化率和感染率均高于其他季节[7]，寄生的鞭虫以吸血为主，Layrisse 等[8]报道每条成虫的日吸血量为0.005mL。感染重者往往导致死亡，对养猪业的健康发展造成一定的威胁[9]。1～4 月龄的仔猪较容易感染和寄生鞭虫，45 日龄仔猪粪便中即可检查出虫卵，4 月龄猪只虫卵数目和感染率均显著提高，而对6 个月龄以上的育肥猪和成年母猪的影响较小，且比较少见相关临床感染报道。少量的猪鞭虫寄生对猪只造成的健康危害不大，但是严重感染时，仔猪则表现出消瘦、血清蛋白降低、贫血、黏膜苍白、皮肤无弹性、被毛无光泽等临床症状[10]。猪鞭虫寄生于结肠和盲肠内[11]，虫体头部深入黏膜，引起结肠和盲肠的慢性卡他性炎症，有时还会出现出血性肠炎，通常为瘀斑性出血，剖检可见结肠和盲肠黏膜有出血性坏死、水肿、结节和溃疡。

目前寄生虫的诊断和分析发现，除使用传统的形态学观察外，随着分子生物学方法的成熟应用，PCR扩增和序列分析已成为寄生虫在分子水平上分类和鉴别的有效手段。为此，本研究采用PCR 方法，扩增疑似猪鞭虫分离株转录间隔区序列（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列并进行测序，BLAST 对比分析，建立猪鞭虫PCR 诊断方法，为今后猪鞭虫的鉴别、诊断、防治以及分子流行病学调查等更深层次的研究奠定基础，以降低猪鞭虫对养猪业造成的经济损失。

1 材料与方法

1.1 虫体样品

猪鞭虫样品来自福建三明某猪场的保育舍小猪盲肠内，70%酒精保存。

1.2 主要试剂

10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq 酶、蛋白酶K、DL-2000 DNA marker 均购自福州晶泰生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 虫体DNA 提取

从70%的酒精保存液中取出一条疑似猪鞭虫虫体，剪成4 段，用双蒸水反复吹打冲洗3 次，用吸水纸吸干虫体表面的水分。分别置于已灭菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中，充分剪碎后用研磨器研磨；加入500μLTES（裂解液）混匀，再加入2μL 蛋白酶K（50mg/mL），充分混匀后，于56℃水浴保温6h，每2h 摇1 次（充分裂解组织、细胞、消化蛋白等），至体系透亮；加入500μL 酚、氯仿、异戊醇混合液，体积比为25: 24 :1，缓慢颠倒5min 混匀，12000rpm，离心10min，取上清液到已灭菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中；加入等体积氯仿、异戊醇混合液，体积比为24 : 1，缓慢颠倒5min 混匀，10000rpm，离心10min，取上层清液到一个已灭菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中；加入3 倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉 淀 DNA，置于-20℃冰箱中保存 30min；12000rpm，离心10min，弃乙醇；-20℃保存的75%乙醇洗涤2 次，12000rpm，离心5min，弃乙醇，用滤纸小心吸干Eppendorf 管壁的乙醇，置于超净工作台干燥1h 左右；加入适量双蒸水溶解DNA（30μL），-20℃保存备用。

1.4 PCR 扩增

采用引物序列NC2（5，-TTAGTTTCTTTTCCTC CGCT-3，）和NC5（5，-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3，）[4]，为扩增鞭虫ITS 及5.8S 基因的保守引物，由上海生工生物工程有限公司合成。预期扩增片段大小约为1500bp，扩增体系为25μL。PCR 反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸90s，进行35 个循环，最后72℃后延伸10min。并设不加DNA 模板的阴性对照。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，将电泳好的琼脂糖凝胶于紫外透射仪上观察并记录结果。

1.5 PCR 扩增产物测序

将PCR 产物寄到上海生工生物工程股份有限公司测序，然后进行序列比较和分析。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳结果

PCR 产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳好后可见约1500bp 的条带，跟预期的目的片段大小一致。DNA 阴性对照无条带出现（图1）

图1 猪鞭虫ITS 序列PCR 产物电泳图

2.2 测序序列对比分析

将测序株在线BLAST 比对，通过DNA star 软件分析测序株与GenBank 上猪鞭虫的同源性。由图2 序列分析可以看出，Longyan（本次试验虫体序列，标注为“China:Longyan，Fujian Province”）与AM9930 03（China:Miluo，Hunan Province）的同源性达93.3%；与AM993005（China:Yiyang，Hunan Province）的同源性达95.3% ；与AM993006（China:Yangjiang，Guangdong Province）的同源性达94.9%；与AM9930 12（China:Zhanjiang，Guangdong Province）的同源性达94.0%；与GQ301555（Cameroon:Kumba）的同源性高达98.7%。综上所述，所扩增序列达到预期要求，该测序株为猪鞭虫。

图2 DNA star 序列分析

3 讨论

对寄生虫进行分类和鉴定是寄生虫学研究的基础和前提，也对防治人、动物和植物的寄生虫病有重要意义。根据形态学鉴定寄生虫是传统的分类和鉴定方法，但是随着生物种群的进化和发展，形态学在不同发育时期寄生虫的鉴别及相似虫体的鉴别存在一定的局限性。近年来，PCR 诊断方法作为一种实用性检测方法，既保证检测的准确性，又保证检测的时效性，是目前应用最普遍的分子生物学工具，该技术因其所具有的敏感性高、特异性强和适合于大规模群体监测的特点，在疾病诊断方面得到了广泛应用。在寄生虫分子分类学研究中，利用核糖体DNA 对寄生虫进行分类学和虫种进化关系学的研究已经成为国际上普遍的应用方法[12]。ITS 是位于寄生虫的遗传物质特别是核糖体DNA（rDNA）的18S 和28S 基因之间区域片段，由于它在种间变异较大，从而可以用作虫种间以及株间的分类鉴定。在现代分子分类学领域，越来越多地采用rDNA 的内转录间隔区（ITS）作为分子标记[13]。罗建勋等[14]对中国境内发现的4种牛巴贝斯虫和一种牛巴贝斯虫未定种进行了18S rRNA 基因测序，并将所测序列与GeneBank 上已经发表的牛巴贝斯虫18S rRNA 比对，研究发现该未定种在基因树上与卵形巴贝斯虫在同一枝上，进而确定该未定种属卵形巴贝斯虫。张龙现等[15]为了准确、快速鉴别人畜隐孢子虫的种类，建立了巢式PCR 扩增隐孢子虫的18S rRNA 基因特殊区域，结果显示，在18S rRNA 基础上建立的PCR-RFLP 方法可以有效鉴别隐孢子虫的种类。

4 结论

该研究对三明地区猪体内分离获得的疑似猪鞭虫，应用PCR 技术进行扩增其ITS 序列，扩增产物经测序后，与GenBank 中的AM993003、AM993005、AM993006、AM993012、GQ301555 进行比对，应用DNA star 软件进行序列分析，同源性分别为93.3%、95.3%、94.9%、94.0%和98.7%，证明该测序株为猪鞭虫。本研究建立了基于ITS 基因猪鞭虫的分子诊断方法，研究结果对猪鞭虫进一步的诊断、鉴定和遗传变异的研究奠定了基础，为猪鞭虫病的临床诊断和流行病学调查提供了科学依据。