复方止泻胶囊的抑菌试验研究

崔潇婷 洪伟鸣 王榕 许瑞

（江苏农牧科技职业学院动物药学院，江苏泰州 225300）

随着我国经济水平的快速发展，畜禽养殖业作为我国畜牧业的支柱产业已发展到一个新高度，然而现在的养殖业不同于传统的养殖，是一个高密度、产业化的过程[1]。而腹泻是常见病，会影响畜禽的生长发育，甚至会危害生命，如果不及时防治，会给养殖业带来相当大的损失。细菌性腹泻十分常见，发生的频率比较高，是畜禽腹泻的主要因素[2]。目前在临床上治疗腹泻的药物有很多，但大部分都用抗生素类药物进行治疗。抗生素的残留会使病原菌的耐药性增加，菌群失调的现象也随之出现，严重影响了养殖业的健康发展。另外抗生素被动物吸收后，会残留在体内，可直接通过食物链进入人体，影响了人类的健康，也带来食品安全问题。虽然其疗效确切，但是长期大量使用抗生素的弊端也逐渐凸现，农业农村部也出台了养殖禁用药的相关政策法规[3]。因此，推行无抗养殖理念刻不容缓，人们开始积极探索治疗畜禽腹泻的中草药，以期从源头上解决抗生素残留的问题，同时既能保护动物，又能避免引起公共危害。根据中兽医辨证论治的原则，复方止泻胶囊以白头翁汤为基础进行科学组方及处方筛选研制出的一种中药复方制剂，以清热解毒、凉血止痢作为立方依据，主治畜禽湿热泻痢型腹泻[4-6]。该文主要对常见致病菌沙门氏菌的抑菌效果进行研究，为复方止泻胶囊后续大规模的生产及最终的药效学评价和临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 试剂

复方止泻胶囊自制；氯化钠注射溶液购自南京小营药业集团有限公司；MH 肉汤培养基、MH 培养基、LB 培养基购自青岛海博生物技术有限公司；庆大霉素原料药购自湖北新和医药有限公司。

1.2 仪器

BBS-SDC 超净工作台（山东博科生物产业有限公司）；WGZ-2XJP 细菌浊度仪（上海圣科仪器设备有限公司）；HH-6 数显恒温水浴锅（常州市亿能实验仪器厂）；SPX-150 生化培养箱（苏州科思洛工业设备有限公司）；ZY-300G 钢管放置器（北京先驱威锋技术开发公司）；XFH-75CA 电热式压力蒸汽灭菌器（深圳市鼎鑫实验设备有限公司）；XS105 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；DZ-1B1恒温真空干燥箱（天津泰斯特仪器公司）；TopPette 手动单道移液器式移液枪（北京大龙兴创实验仪器股份公司）。

1.3 试验菌株

沙门氏菌由江苏农牧科技职业学院省生物制药高技术研究重点实验室提供。

1.4 试验动物

体重（20±2g）纯昆明种小鼠，由江苏农牧科技职业学院实验动物中心提供，雌雄各一半，根据性别分笼饲养。动物房温度为（20±2）℃，湿度为（60±5）%，环境保持安静没有噪声。

2 方法

2.1 菌液、受试药液的制备

菌液制备：按照无菌操作的要求，用接种环从冷冻保存的沙门氏菌斜面上取一环菌苔接种到MH 肉汤培养基中，于37℃恒温培养箱中20h，然后用MH 肉汤培养基稀释，配制浓度为1×107CFU/mL 的菌液，放到4℃的冰箱中备用。

复方止泻胶囊溶液的制备：称取50g 复方止泻胶囊内容物，加入100mL 无菌蒸馏水，充分研磨使溶解，然后低温浓缩至50mL，即获得药物浓度为1g/mL 的试验药物。用微孔滤膜滤过，放入4℃冰箱保存备用。

2.2 牛津杯抑菌试验

操作之前，将MH 培养基加热溶化后置于恒温水浴锅中进行保温，设置温度为50℃。吸取20mL 培养基到无菌的培养皿中，制备5 个平板，冷却20min，等到琼脂凝固后更换干燥的陶瓦盖。用移液枪往每个平板上加200μL 沙门氏菌菌液，用灭菌的涂布棒使菌液摊布均匀。涂布结束后将平板放置到36℃的恒温培养箱中保温15min，让菌液慢慢渗透，平板表面也变得干燥。

取出来后，每个平板用钢管放置器等距离均匀放入4 个灭菌的牛津杯，静置10min。牛津杯在培养基内下沉稳定后，分别加入灭菌生理盐水溶液200μL、庆大霉素溶液（100mg/mL）200μL、复方止泻胶囊溶液（1000mg/mL）200μL、复方止泻胶囊溶液（500mg/mL）200μL，放到36℃恒温培养箱中培养20～24h。为了避免培养温度对细菌生长的影响，培养过程中尽量不要开启培养箱。培养好后，打开陶瓦盖，将牛津杯倒入消毒液中，用玻璃盖替代陶瓦盖。弃去破圈或者圆不完整的平板，用游标卡尺测量抑菌圈的直径，求平均值。

2.3 药物MIC 测定

采用试管二倍连续稀释法。取30 支无菌试管，每批用10 支，编号1～10，按照顺序排列在试管架上，做3 批试验。

分别往每支试管中加入无菌的LB 液体培养基5mL。1 号管加入浓度200mg/mL 的复方止泻胶囊的溶液5mL，混合均匀后，吸取5mL 放入2 号试管，充分混合均匀后，再吸取5mL 放入3 号试管，如此稀释到8 号试管，8 号管混合均匀后吸取5mL 弃去。稀释之后1～8 号试管的浓度分别为：100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.125、1.56 和0.78mg/mL。9 号管做阳性对照，10 号管做阴性对照。1～9 号管分别用移液枪吸取0.1mL 的菌液，10 号管不加菌液加药液。

放到恒温培养箱中36℃培养18～24h，观察试管中的浑浊结果。根据培养基浑浊的情况来判断有没有细菌生长，浑浊说明有细菌生长。试管内清澈不出现浑浊的最高稀释管的浓度为复方止泻胶囊的最小抑菌浓度（MIC），也是没有细菌生长的最小药物浓度。

2.4 体内抑菌试验

进行菌液致死剂量的预试验，将复苏后的沙门氏菌菌液稀释不同的浓度。每只小鼠注射剂量为0.5mL，观察3d，引起小鼠80%～100%死亡的细菌浓度是4×108CFU/mL，此浓度作为沙门氏菌对小鼠的攻毒剂量[7]。

取健康无伤的昆明小白鼠100 只，雌雄各一半。随机分为5 组，每组20 只，雌雄各一半。前3 组为复方止泻胶囊药物试验组，设高、中、低三个剂量组，剂量分别是20、15、10g/kg·bw。试验4 组为感染对照组，试验5 组为正常对照组。

前3 组灌胃给药，采用等体积不同浓度，每次0.4mL，持续3d，每天上下午各一次。试验4 组和5组注射同等体积的生理盐水。第4d，除了第5 组正常对照组不注射菌液，其他4 组给每只小鼠腹腔注射浓度为4×108CFU/mL 的沙门氏菌菌液0.5mL，第5 组注射0.5mL 的生理盐水。再继续灌胃3d，观察感染沙门氏菌后小鼠的死亡数。统计各组的死亡情况，计算成活率。

3 结果

3.1 牛津杯抑菌试验

牛津杯抑菌试验结果见表1。体外抑菌敏感程度根据抑菌圈的直径来进行判断，标准为：无抑菌圈为不敏感，小于10mm 为低度，10～15mm 为中度，大于15mm 以上为高度[8]。由结果可知，庆大霉素对沙门氏菌的抑菌圈直径为22.36mm，1000mg/mL 复方止泻胶囊溶液对沙门氏菌的抑菌圈直径达到17.98mm，虽然没有抗生素的抑菌效果好，但是也达到高度敏感的程度。500mg/mL 复方止泻胶囊溶液的抑菌效果也达到中度敏感的效果，说明复方止泻胶囊的抑菌效果较好。

表1 抑菌圈直径

3.2 药物MIC 测定

药物MIC 测定结果见表2。与10 号阴性对照管比较，三个批次样品的4 号管清澈、5 号管颜色刚变浑，表明5 号管有少量的细菌生长，4 号管此时的试管浓度是12.5mg/mL。说明复方止泻胶囊的最小抑菌浓度（MIC）为12.5mg/mL。

表2 试管中细菌生长情况

3.3 体内抑菌试验

体内抑菌试验结果见表3。根据统计结果显示，复方止泻胶囊高剂量组的小鼠存活率达到70%，感染对照组的小鼠存活率只有15%，提高了55%。同时复方止泻胶囊中、低剂量组小鼠的存活率都高于感染组。可以看到复方止泻胶囊在体内对于沙门氏菌引起的感染有明显的抗感染作用，不同剂量的药物都能提高小鼠的存活数，起到很好的保护作用。

表3 体内抑菌试验结果

4 讨论

4.1 关于体外抑菌试验

体外抑菌试验可用于药物对细菌敏感性的测定，沙门氏菌又是引起腹泻的常见致病菌。通过对中药制剂复方止泻胶囊的抗菌作用进行定性和定量试验，采用管碟法做定性试验和试管法做定量试验，配合使用这两种方法，能比较全面、合理的评价该药物的抗菌活性。试验结果表明复方止泻胶囊对沙门氏菌的抑制作用比较强，随着药物浓度的增加对细菌的抑制效果也在增强，试管法测得MIC 值为12.5mg/mL。该浓度能充分抑制病原菌的生长，此时宿主的防御功能也会发挥作用，能有效地清除入侵的细菌。影响管碟法结果的因素很多，我们需要注意试验器材的清洗、培养基的加注，钢管的放置以及培养时间的控制，稍有不慎就容易出现抑菌圈不正常的现象，影响试验结果的判断[9]。MIC 测定时，菌液的浓度、培养基的制备以及培养时间都会影响试验结果[10]。体外抑菌试验操作环节都需小心谨慎，严格遵守无菌操作技术。

4.2 关于体内抑菌试验

体内抑菌试验中，将能导致小鼠死亡剂量的沙门氏菌注入小鼠体内，这些小鼠作感染模型，再将复方止泻胶囊溶液的不同剂量灌胃给药对其给予治疗，观察存活率[11]。同时设置感染对照组和正常对照组，感染对照组只给相同菌量，不给药物；正常对照组不注射菌液，以生理盐水替代，作对照比较。经过多次预试验，发现小鼠注射菌液后，食欲缺乏，死亡时间主要在2d 内，3d 后基本恢复。所以试验过程中，我们提前3d 进行灌胃给药，菌液注射后，再连续给药3d 试验结果效果良好。结果表明，复方止泻胶囊可以提高沙门菌感染小鼠的存活率，起到了较好的保护作用。

5 小结

复方止泻胶囊对沙门氏菌具有良好的抗菌作用，最小抑菌浓度（MIC）为12.5mg/mL，对其感染的小鼠也具有较好的保护作用，