基于物种特异性单一DNA标记扩增检测的食品真实性定性鉴别技术研究进展

陈爱亮

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

食品欺诈（Food fraud）是指企业或个人故意在食品的完整性方面欺骗他人以获取不正当经济利益的行为[1]。近年来，随着食品工业化发展和经济的全球化，食品供应链也越来越复杂，在经济利益的驱动下，用低成本低质量食品冒充高价值高质量食品的食品欺诈事件频频发生，几乎发生在所有的食品领域[2]，包括动物类产品，如肉类、乳品、水产品、蜂蜜；植物类产品，如果汁、红酒、食用油、谷物以及中药材、植物性膳食补充剂、香料等。而且标签错误率居高不下，如在意大利销售的加工肉制品和鱼片上标签错误比例分别高达57%和42.8%[3～4]；在美国销售的肉制品、对虾产品、山羊乳制品则分别有高达35%、24.4%和80%的标签错误率[5～7]。2020年，全球各地仍然发生了多起马肉冒充牛肉事件。在国内，研究人员们对来自30种不同品牌的153份烤鳕鱼片样本进行了脱氧核糖核酸（DNA）检测，发现58%的样本存在被其他低值鱼类冒充或标签错误的情况[8]；对市场上银鳕鱼和南极犬牙鱼进行鉴定，发现85%的产品存在假冒或标签错误的情况[9]。根据美国消费品牌协会的数据，大约10%的商业化生产的食品受到了食品欺诈的影响。

食品真实性鉴别（Food authentication）是指通过对食品的组成性质等进行分析，验证其是否符合其标签所示成分、营养等信息的过程。应对食品欺诈，执行相关食品欺诈法规都需要食品真实性鉴别技术的支撑。近年来，一系列食品真实性鉴别技术被开发出来用于食品欺诈分析[2]，按技术原理主要分为4类，即化学方法、物理方法、蛋白质方法和DNA方法。化学方法主要通过分析食品的组成成分对食品进行真实性鉴别，如利用色谱—质谱技术、核磁共振技术、红外光谱和拉曼光谱技术等分析食品内特征代谢物成分，其主要用于食品掺假、替代、稀释、增强等改变食品成分组成的食品真实性鉴别分析。食品中的稳定同位素以及矿物元素组成主要与食品产地有关，因此稳定同位素和矿物元素分析技术主要用于食品产地的溯源鉴别。蛋白质和DNA技术，尤其是DNA技术，主要用于食品中物种源性成分的分析，如欧洲马肉掺假鉴别最主要应用的技术就是DNA分析技术。

从应用场景来分，这些技术又可以分为两类，一类是需要精密仪器和复杂操作步骤的技术，主要应用于专业的实验室，如稳定同位素质谱技术、高分辨率核磁共振技术等。另一类是基于DNA分析的荧光定量PCR技术、基于抗原抗体的ELISA技术以及正在发展的便携式光谱技术，这些技术更适用于普通实验室，甚至是现场的快速检测。尤其是欧洲马肉风波以后，欧洲各国政府认识到有必要开发更多的基于DNA的分析技术，并在官方实验室中进行应用，将DNA技术确立为验证食品真实性和执行食品成分、标签和标准立法的常规检测手段。本文概述了DNA分析技术在食品真实性鉴别中的重要性，综述了物种特异性单一DNA标记主要类型及目前常用的扩增检测技术优缺点，并探讨了基于物种特异性单一DNA标记扩增检测的食品真实性鉴别技术的未来发展趋势。

一、DNA分析技术在食品真实性鉴别中的重要性

选择DNA分析作为食品真实性鉴别的主要技术，尤其是食品中物种源性成分鉴定的主要技术，是因为鉴别食品的成分首先需要鉴别食物是什么种类。相对于质谱等其他具体成分分析技术而言，DNA分析技术具有简单、快速、准确等优点。DNA作为生物的遗传物质决定了生物种属差异，且两个物种在进化上距离越远，DNA差异也就越大。DNA分析技术甚至可以被用来进行生物的个体鉴定，如畜产品个体溯源等。

蛋白质、代谢物、矿物元素等容易受气候、环境以及食品加工过程影响而发生变化，相对而言，DNA则从动植物生长到成熟到深加工制品整个食物链上都具有非常好的一致性和深加工热稳定性，而且DNA在生物体的不同部位也都完全一致，使其成为食品真实性鉴别和溯源的最佳标志物之一[10]。

20世纪90年代初，英国农业、渔业和食品部（MAFF）开始资助研究开发检测食品欺诈的分析方法，其中包括应用法医DNA图谱来确定食品的真实性。但直到2003年欧洲马肉风波发生后，才真正推动了DNA技术在食品真实性鉴别中的应用和发展。DNA分析技术早期的应用包括从基因序列中简单鉴定单个肉类和鱼类物种，以用于食品真实性鉴别。如今DNA技术已经发展到更广泛的食品、农产品、饲料真实性分析，包括植物源性食品鉴别（如果汁掺假）、转基因食品（GMO）鉴别、植物品种鉴定（如印度巴斯马蒂香米鉴别）、过敏原检测、病原微生物的检测与鉴定等。

目前，应用于食品真实性分析的DNA分析技术主要分为3类。第1类是基于物种特异性单一DNA标记的核酸扩增分析技术。这类技术主要是针对食品中不同物种类型鉴别，这些物种通常可以筛选到单一DNA标记，通过PCR或者等温扩增等方法实现简单快速的鉴定。第2类是基于DNA多态性位点的指纹图谱分析技术。这类技术主要针对近缘物种或者同一物种内部不同品种进行分析，需要依据多个DNA多态性位点进行DNA指纹图谱分析以实现鉴别，主要包括微卫星技术、单核苷酸多态性技术等。第3类是基于DNA条形码的测序分析技术。DNA条形码作为物种鉴别的科学依据，尤其适合用于外观形态遭受破坏的食品物种源性成分的鉴别，而且其作为非靶向性检测方法，结合高通量测序，在混合食品中物种成分鉴定方面愈来愈受重视。

目前，基于DNA分析的食品真实性鉴别技术主要用于食品欺诈中物种源性成分分析，由于食品欺诈行为种类方式复杂多样，因此针对特定的食品欺诈行为选择合适的鉴别方法成为食品真实性鉴别的挑战之一，有时可能需要多种方法联用才能确定食品的真假以及来源。

二、物种特异性单一DNA标记

物种特异性单一DNA标记是指某物种特有的一段DNA序列，其在物种间的变异程度足够可以通过PCR扩增等技术手段与其他物种鉴别开，即通过检测某一个目标DNA片段达到识别食品中某个物种成分的目的。单一DNA标记检测技术因简单、快速、直接，成为食品真实性定性鉴别的主要手段。当然，选用单一DNA标记进行鉴别的前提是能够找到具有物种特异性的DNA片段并且通过扩增技术检测出来。

（一）线粒体DNA标记线粒体脱氧核糖核酸（mtDNA）或植物叶绿体等细胞器DNA和核染色体DNA（nDNA）区域都已经被用于进行物种鉴定，但使用线粒体DNA标记的应用更多。原因在于：一是动物线粒体DNA具有更强的种间和种内变异性[11]， 它是单倍体非重组DNA， 呈母系遗传[12]，突变率比核染色体DNA高5～10倍，因此容易寻找到用于鉴别不同物种甚至是近缘物种的种属特异性DNA标记。二是哺乳动物细胞内存在大量的线粒体，每个细胞中线粒体数量大概从几百到几千个，而核染色体上DNA靶标的丰度则要少得多。这样对于同样数量的样品，线粒体DNA更多，容易分离获得，也就意味着更好的灵敏度，适用于量少的样品。三是相比于核染色体DNA，线粒体DNA对温度、压力抗性更强，更稳定、抗降解，因此更适用于长期久置的样品（如头发、骨骼以及牙齿等）以及加热、加压、加工处理后的食品。

与核染色体基因组相比，线粒体基因组较小，在动物中线粒体基因组全长一般16 000 bp，因此相对容易寻找合适的物种特异性DNA标记。目前已经报道了许多线粒体DNA标记被用于物种的鉴别，其中最常用的是细胞色素b（Cytb）和D-loop。Cytb是整个线粒体基因组中最保守的区段，而D-loop则是物种间变异最大的区段，因此成为物种鉴别中最常用的目标DNA标记。其他常用的线粒体基因组标记还包括12S rRNA、16S rRNA、COI、ND4、ATP6、ATP8、ND5、内部转录间隔区等。例如，2013年马肉风波后，欧盟推荐的鉴别马肉的实时荧光定量PCR方法选择的目标基因片段即为线粒体DNA（ND4基因，NADH脱氢酶亚单位4）上的87 bp片段，经过实验验证，该区域有足够的变异可以将马肉特异性扩增，而其他哺乳动物、鸟类、鱼类等动物，以及植物类大豆、玉米、蔬菜等共46种动物和7种植物均没有扩增信号。

（二）核染色体DNA标记除了线粒体DNA，近年来也有一些核染色体DNA标记被筛选出来用于物种的鉴别，多用于定量分析。除了筛选物种特异性DNA片段外，筛选多个物种或者所有物种通用的DNA标记在物种鉴别中也起到非常重要的作用。这类引物有时可以作为简化多重鉴别操作的手段[13～14]，有时也可以作为检测某一类物种的标记片段或者作为检测的内参质控手段。有时线粒体DNA无法满足要求，需要从核染色体上寻找合适的DNA标记。例如，为了区分动物与植物，经常选用动物编码肌球蛋白的DNA片段来对动物源性成分进行检测，其可以用于素食食品的鉴别。

另外近缘物种之间线粒体基因组非常相似，例如，欧洲野猪（Sus scrofa scrofa）和家猪（Sus scrofa domesticus）两个物种线粒体基因组有99%的同源性（根据BLAST），而且只有一个位点突变，因此不能用于物种鉴定。这时可以从核染色体上寻找一些特定的性状基因（如颜色决定基因MCR1）进行鉴别[15～16]或者选择DNA多态性标记（如微卫星位点）进行鉴别[17]。

此外，线粒体数目通常在同一生物体的组织之间或来自不同个体的同一组织之间存在差异，在不同的细胞中数目也不同且高度可变，因而使得利用线粒体DNA标记进行食品掺假定量分析时的误差变大。而核染色体DNA通常有更稳定的拷贝数，不同组织、不同细胞间拷贝数一致，用来进行食品掺假定量分析也就更为准确[18～19]。目前，常用的核染色体物种鉴定DNA标记有哺乳动物生长激素受体（Growth hormone receptor，GHR）[18]、管家基因复制蛋白A1（Housekeeping gene replication protein A1，RPA1）[20]、核F2基因内含子[21]、HEG1基因[22]、LHB基因[23]、藏红花Mg-protoporphyrin monomethyl ester cyclase基因[24]、蜜蜂核基因组蜂王浆蛋白2（MRJP2）基因[25]等。另外，有些通用的核染色体单拷贝DNA标记也被筛选出来作为掺假定量分析的参考归一化基因，例如哺乳动物/家禽肌肉生长抑制素基因[18，23]、鱼通用基因a-skeletal actin[26]、鱼类肌肉组织主要蛋白质小清蛋白（Parvalbumin）的核基因内含子[27]、鱼PanI基因片段[28]等。

虽然单一DNA标记更为简单直接，开发检测方法也更为容易，但这类标记主要适用于种属的鉴别，因为在进化中已经发展出足够的种间变异用于区分不同的物种。很多情况下，同一种属内不同品种之间因为亲缘关系较近，难以找到某单一DNA片段具有足够的基因变异可以区分不同的品种，这时候就需要采用多个DNA标记，一般是DNA多态性标记来进行食品的真实性鉴别。

三、物种特异性单一DNA标记扩增检测技术

目前，用于物种特异性单一DNA标记扩增检测的技术主要包括聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术和等温扩增技术两类。

（一）聚合酶链反应技术现代DNA分析是建立在核酸扩增（NAA）技术基础上的，聚合酶链反应则是核酸扩增最主要的技术，具有设计简单、灵敏度高和特异性强的优点，包括第一代终点法PCR和第二代实时荧光定量PCR方法。

1.终点PCR法。终点PCR方法作为第一代PCR方法，需要依靠凝胶电泳对扩增产物进行分析，并根据扩增产物片段大小进行鉴定。最初物种鉴定方法都是基于终点PCR方法开发的，例如利用这种方法发现了我国台湾地区羊奶粉里掺牛奶粉的概率在25%，羊奶片的掺假率在50%[29]；利用同样的方法在捷克羊奶酪产品中发现了牛奶成分掺假[30]；在埃及水牛奶鉴别中发现有14%完全是纯牛奶，还有38%是掺假了牛奶的水牛奶[31]。终点法的优点是扩增片段长度不受限制可以从100 bp到1 000 bp，因此可以针对不同靶标设计不同长度的扩增片段，在同一管中进行扩增，然后通过电泳分离根据片段大小进行多重检测[32～33]。终点PCR方法的缺点是PCR完成后还需要通过凝胶电泳对扩增产物进行检测，操作复杂。

2.实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR技术作为第二代PCR技术，通过掺入荧光染料或者采用荧光探针的方式，观察荧光信号的强度实时监测PCR产物的产生，避免了传统终点PCR方法依赖电泳观察的繁杂操作步骤。同时，其具有半定量或者相对定量的优点，而且在精密度、分析速度、灵敏度和自动化方面也都有更好的性能，已成为生物化学、分子生物学、食品安全和分子诊断学中不可或缺的研究工具，也成为当前食品真实性鉴别中最主要的技术。

目前已经开发了多种用于动植物源性成分鉴定的荧光定量PCR方法，常见肉类、鱼类、植物物种源性鉴定的食品安全国家标准、农业行业标准、出入境检验检疫行业标准等也都已经发布。利用荧光定量PCR进行物种鉴别是通过观察荧光扩增曲线进行判断，理论上，检测到针对待测样品的荧光探针扩增信号被认为是阳性反应，但是由于PCR方法高度灵敏，因此在实际中，经常设定一个报告阳性结果的Ct阈值，避免潜在因为污染等原因造成的假阳性结果。

2013年马肉风波后，欧盟最先推荐的就是利用荧光定量PCR方法进行牛肉中马肉的鉴别，而且给出了具体的引物探针序列和操作方法标准作业程序（SOP），如前所述，该方法对马肉鉴别非常特异，低至0.1%的马肉也可以准确的检出。

3.多重PCR方法。在很多情况下，食品掺假经常可能掺有多种可能的成分，因此需要开发多重PCR方法，同时检测多个指标。多重定量PCR方法主要分为3类：第1类是传统PCR方法，根据不同鉴别对象扩增后产生的片段大小的不同，可以通过电泳进行鉴别[32，34～36]。第2类是通过Taqman探针法荧光定量PCR，这类方法主要依靠设计多个波长的荧光探针，实现多重检测[37～38]。第3类是染料法荧光定量PCR，也称为熔解曲线法（High resolution melt，HRM）。不同物种DNA片段扩增Tm值不同，通过熔解曲线进行鉴别。例如，利用通用引物对Cytb基因148 bp片段进行扩增，可以同时对牛、羊、家猪、马、穴兔、鸡、野生火鸡和鹌鹑肉类进行鉴别[39]。SOARES等[40]以中华蜜蜂和意大利蜜蜂的16SrRNA基因为靶点，开发了基于高分辨率熔解分析的实时PCR方法用于两种蜂蜜的鉴别。目前利用线粒体不同DNA标记，已经开发了很多多重肉类[41～44]、奶类[45]的鉴别方法。

但是基于PCR扩增的DNA分析方法在实际应用中会遇到一些因素的限制，例如依赖复杂昂贵的热循环仪器；复杂食品样本在提取时会有抑制PCR扩增的抑制剂从而影响扩增效率等。为了解决这些问题，近年来多种基于等温扩增的DNA分析方法被发展起来。

（二）等温扩增技术等温扩增方法不需要热循环过程和复杂的热循环仪器，与传统的PCR方法相比，扩增效率更高，因此扩增时间更短。同时有研究表明，由于使用了与传统Taq酶不同的、在等温条件下扩增的DNA聚合酶，其对复杂基质（如食物和临床样本）中发现的经典PCR抑制剂具有更强的耐受性，也就意味着等温扩增方法可以最大限度地简化样本前处理过程[46～47]。再加上不需要昂贵复杂的热循环仪器和扩增时间的缩短，使得等温扩增方法更适合于开发现场快速便携式的鉴别方法。

目前已经开发出基于多种原理的等温扩增方法，如链置换扩增（SDA）技术、滚环扩增（RCA）技术、交叉引物扩增（CPA）技术、依赖解旋酶DNA等温扩增（HDA）技术、环介导等温扩增（LAMP）技术、重组酶聚合酶扩增（RPA）技术等。其中比较成熟且常用的技术包括LAMP技术和RPA技术。

1.LAMP技术。LAMP通常在60～65℃条件下进行，4个内部引物加2个外部引物在Bst DNA聚合酶的作用下，利用自动循环链的位移实现目标DNA片段的快速扩增。利用实时荧光LAMP方法，在有外引物存在的情况下，通常在15 min左右即可实现扩增，30 min检测完毕。同时由于采用了4～6条引物，赋予了其扩增更高的特异性[48]，加上Bst酶本身对基质干扰物的低敏感性，使其获得了广泛应用。尤其是2020年LAMP技术专利过期后，该技术配套各种简易样品前处理方法和现场快速检测装置，被广泛应用于核酸检测领域。SUL等[49]开发了一种基于LAMP的针对16SrRNA基因的方法，用于肉类加工产品中鸡肉的快速现场检测，可从简易制备的样品中直接检测鸡肉的存在，基因组灵敏度达到10 fg。利用LAMP技术还开发了鳕鱼与油鱼[50]，三文鱼、大马哈鱼、虹鳟鱼[51]，有毒蘑菇[52～54]等系列鉴别方法，并且通过将LAMP与微流控芯片技术相结合，实现了多种奶产品的多重检测[55]。

LAMP技术不足之处在于需要针对4～6个目标序列设计引物，因此引物设计过程相对复杂，同时由于多引物的存在，需要注意潜在的引物—引物非特异性扩增导致的假阳性，需要仔细设计引物以及调整体系的引物浓度，开发起来相对PCR要复杂一些。此外，复杂的扩增过程产生串联扩增产物，这限制了简单检测方法（如琼脂糖凝胶电泳）的使用，需要应用实时荧光等方法[56]。

2.RPA技术。RPA是一种相对较新的等温扩增技术，其机制与PCR相似，但利用重组酶—引物复合物来识别和引发链位移，从而消除了对热模板变性的需要，通过指数放大实现快速扩增，通常在20 min内完成。同时RPA反应温度一般在37～42℃，对仪器的需求进一步降低，结合新开发的实时荧光探针以及相对容易的多通道检测，可满足现场便携、多种目标快速检测的需求。而且RPA还可以与试纸条技术相结合，实现羊肉[57]、牦牛奶[58]等现场快速鉴别。

3.其他等温扩增技术。目前，其他等温扩增技术也在食品真实性鉴别方面获得了应用。例如，利用CPA技术检测肉类混合物中的羊肉物质，其检测限为1%（w/w）[59]。

相对于PCR技术，等温扩增技术以其便于现场应用、对于复杂样品基质抗干扰能力强等优点，正逐渐成为英国和欧盟食品真实性鉴别执法中重点应用的技术。新冠肺炎疫情的爆发促使现场便携式乃至家用快速核酸检测技术、装备得到发展，将等温扩增技术与侧流层析试纸条技术[60～61]结合或者集成到微流体装置中[62～64]，以实现检测的自动化、集成化，正成为等温技术发展的趋势。

四、DNA标记分析用于深加工食品真实性鉴别的注意事项

需要指出的是，利用DNA标记进行食品真实性鉴别，尤其是深加工食品的鉴别，选择的DNA目标片段不适宜过长，一般应在250 pb以内，最好在100 bp左右。这是因为高温高压等加工条件能够将DNA切割成短片段，且加工越多，条件也越苛刻，DNA降解越严重，例如，暴露在3.2×105Pa的压力下会产生大约100 bp的片段。因此，针对深加工制品，设计的PCR扩增目标片段宜短不宜长。当然，在生肉或一般熟肉制品中，DNA不会降解那么多，但设计短DNA片段的方法应用更广，无论加工程度如何，都可以进行检测。为了应对DNA目标片段被降解，还有一种办法就是设计两个或多个目标片段进行检测[65～66]，因为两个目标片段同时都被降解掉的概率非常低，从而保证检测结果的可靠性。

目前DNA分析技术已经成为食品真实性鉴别的重要支撑技术之一，被广泛应用于与物种成分相关的食品真实性鉴别中，最常见的是肉类、奶类、转基因食品、果汁等产品鉴别，这类产品DNA含量丰富，因此检测相对容易。除了这些产品，基于DNA的真实性分析还被用于一些深加工制品，如葡萄酒[67]、 食用油[68～70]、 蜂蜜[40]等。 当然对于这类产品进行DNA分析需要优化DNA提取方法[70～72]，因为在精炼深加工的过程中大部分DNA被去除[69]，剩余残存DNA也存在降解严重的情况。因此，宜选用小片段目标DNA以及在叶绿体或者线粒体中高拷贝数的目标DNA片段，例如选用高拷贝数的植物5SDNA间隔转录区作为目标片段进行菜籽油、玉米油、向日葵和大豆油鉴别，甚至可以对提取的模板进一步稀释达到减少PCR抑制的目的[68]。

五、未来发展趋势与展望

综上所述，在目前应用于食品真实性鉴别的DNA分析技术中，基于物种单一性DNA标记扩增的检测技术是最为成熟、稳定和可靠的技术，已经被用于各类食品物种源性成分的鉴定。而且目前已经开发有商品化的试剂盒，含有进行食品物种鉴别的各种试剂，大大方便了食品生产经营者以及消费者使用。如德国BIORON Diagnostics GmbH公司和BIOTECON Diagnostics GmbH公司提供了猪肉、骆驼肉、马肉、牛肉、鸡肉、火鸡肉、山羊肉、绵羊肉、驴肉、鸭肉、虾肉和蟹肉等肉类鉴别荧光定量PCR试剂盒，可用于生熟食品以及饲料样品鉴别。美国Eurofins GeneScan公司也开发了动物肉类鉴别系列定量PCR试剂盒，包括牛肉与野牛肉、猪肉（包括野猪肉）、牛肉与猪肉、鸡肉、火鸡肉、鸭肉、鹅肉、山羊肉、绵羊肉、马肉、水牛肉和驴肉等。国内北京新羿生物科技有限公司与中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所合作，也推出了可用于猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、马肉、驴肉、骆驼肉等常见肉类，以及大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、油鱼、三文鱼、虹鳟鱼、大马哈鱼等常见水产品的实时荧光LAMP试剂盒产品。

但是目前大部分荧光定量PCR试剂盒检测时间长，DNA提取步骤复杂，一般还需要在实验室中进行，但无论生鲜食品还是熟制食品，其容易腐败变质的特性都需要现场快速的食品真实性鉴别方法，以不影响食品销售等活动。如前所述，近年来针对物种特异性单一DNA标记扩增检测的荧光定量PCR技术和等温扩增技术在便携快速检测方面都取得了很大的进步。尤其是全球新冠疫情促进了现场乃至家用核酸快速检测技术的研发，这些技术也被平移到食品真实性鉴别领域，提高了食品物种源性成分鉴定的效率。这其中首先是DNA快速提取方法，各种DNA快速提取液的出现，避免了常规磁珠或膜柱法洗涤洗脱等多步骤操作，食品样品中加入裂解液，简单裂解后即可取上清液用于后续扩增反应。其次在扩增方面，等温扩增技术如LAMP或者RPA技术等显现出了比荧光定量PCR更适合现场应用的前景。等温扩增技术不需要复杂昂贵的热循环仪器，便于现场应用，同时没有升变温、变性、复性的过程，扩增效率更高，实时荧光LAMP技术可在30 min完成扩增，而实时荧光R PA更快，可在20min内完成扩增。而且这两种扩增技术都采用了实时荧光检测法，边反应边检测，无需后续电泳或其他方法，结合快速DNA提取，基本上可以在30 min左右实现从提取到扩增检测全过程。近年来，LAMP及RPA技术还和微流控芯片、纳米材料以及生物传感器结合，开发了更加自动化、集成化、便携式的现场快速检测装置，更进一步提高了检测的效率，其中等温扩增技术和试纸条技术相结合，具有快速简单、成本低等优点，在食品真实性鉴别中显示出良好的应用前景[73～74]。

另外一个重要的问题就是定量和非靶向分析的问题。虽然本文只综述了目前基于DNA标记扩增检测的食品真实性定性鉴别方法，但是定量分析对食品掺假鉴别来说尤为重要。主要是因为目前基于单一DNA标记的核酸扩增方法灵敏度非常高，基本上1%甚至0.1%都能检测出来。而这种含量很低的情况很多是由于和其他种类食品共用生产线，没有清洗干净而发生的无意沾染现象，并不是蓄意掺假。因此，为了更好的监管和执法，避免假阳性的情况，需要对食品掺假进行定量分析。除了定量，还有一个需要解决的问题是非靶向分析，即在食品掺假物种未知的情况下，可以对食品所包含的种类进行鉴定，避免因为掺假物种未知无法检测，出现假阴性的情况。目前已经开发了一些基于DNA分析的食品掺假定量分析和非靶向分析方法，如荧光定量PCR、数字PCR、DNA条形码、高通量测序技术等，但这些技术还不是非常成熟，处于发展完善之中。

除了商品化试剂盒促进应用，进一步开发现场便携式技术以及定量和非靶向分析方法之外，食品真实性鉴别与原来食品安全检测相比，属于一个比较新的领域，在标准和标准物质方面还需要进一步加强。虽然我国已经在国家标准、行业标准及团体标准中制定了一系列食品、饲料物种源性成分的荧光定量PCR鉴定方法，但目前还不能形成体系，不能满足市场检测需求。同时作为参考物质的食品真实性鉴别用标准物质和标准样品，市面上还几乎没有，因此也需要尽快研制常见食品种类的标准参考物质，提高鉴定的准确性，最后形成一套比较完整的食品真实性鉴别技术体系。