Folin-Ciocalteu比色法测定茶酵素中多酚含量的方法学研究

尚 琪 石美荣 苏小育 雷 超 李建文 张春娟

（渭南市检验检测研究院，陕西渭南 714000）

酵素是以动物、植物、菌类等为原料经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品。作为国内新兴行业，对其产品成分和功效研究尚处于基础研究阶段。目前，检验检测机构主要依据团体标准及各大企业提供的产品标准对酵素各项指标进行检测，检测方法均采用国家现行的相关标准方法[1～3]。但目前市场酵素产品为改善口感、提高产品膳食纤维，普遍添加了20%～30%的低聚异麦芽糖、低聚半乳糖等低聚糖[4]，对于样品前处理及反应条件，若采用通用标准方法检测具有一定的局限性甚至不适用性。

多酚具有抗氧化、助消化、降血脂、抗癌等多种生物活性[5～8]，是大多数酵素产品的特征性指标之一[9～12]。以茶叶为原料制得的茶酵素产品中多酚含量的测定，现采用GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[13]。该方法主要应用于茶叶中提取的茶多酚含量测定，而茶酵素产品与茶叶提取物存在差异性，故需结合茶酵素产品自身特点，对样品前处理及最佳反应条件进行优化研究，建立茶酵素产品的多酚检测方法，从而可推广应用于其他富含多酚类物质酵素产品中多酚含量的测定。基于此，本文主要对茶酵素产品中多酚含量测定的Folin—Ciocalteu比色法的前处理及最佳反应条件进行了研究。

一、材料与方法

（一）材料与仪器设备液体茶酵素（渭南茶酵酵素发展有限公司）；固体茶酵素（四川省食品发酵工业研究设计院果蔬实验室）。无水碳酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；Folin—Ciocalteu试剂（BR，国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸标准储备液（1 000 g/mL）：称取0.1±0.001 g一水合没食子酸，于100 mL容量瓶中溶解、定容（现配）。T9S双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；GL—20 G—Ⅱ高速（冷冻）离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ—500 E超声波辅助提取仪（昆山市超声仪器有限公司）。

（二）前处理条件的优化

1.pH。液体样品：称取适量试样于烧杯，室温超声10～20 min，除去试样中气体至质量稳定，超纯水补至初始质量。再准确称取以上试样2.0 g（精确至0.001 g），加超纯水20 mL，于40℃水浴超声30～50 min，冷却至室温，用醋酸—醋酸钠缓冲液调节pH呈梯度 （3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），并定容至100 mL备用。

固体样品：根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[14]的规定，测定试样水分含量，计算干物质含量，干物质含量＝（1—水分含量）×100%。将已确定干物质含量的固体样品过0.20 mm孔径筛，取筛下物，称取1～2 g，加入超纯水（温度≥60℃）20 mL，于50℃水浴超声30～50 min，冷却至室温。如有浑浊或沉淀，以6 000 r/min离心15 min，冷却至室温，用醋酸—醋酸钠缓冲液调节至不同pH，并定容至100 mL备用。

移取上述供试液各1.0 mL于25 mL刻度试管内，按照GB/T 8313—2018的条件进行显色反应，于最佳波长下测定吸光值。

2.低聚糖。按照上文样品制备方式处理样品后，用醋酸—醋酸钠缓冲液调节至最适pH，并定容至100 mL。随后缓慢加入85%无水乙醇，同时使用涡旋振荡器混匀，置超声波提取器中室温超声提取30 min。提取结束后，以6 000 r/min离心15 min，收集上清液。将离心沉淀物用85%乙醇超声提取2～3次，以6 000 r/min离心15 min，合并上清液，定容至100 mL容量瓶备用。

移取上述供试液各1.0 mL于25 mL刻度试管内，按照GB/T 8313—2018的条件进行显色反应，于最佳波长下测定吸光值。

（三）Folin-Ciocalteu比色法反应条件的优化

1.样品制备。按照 “（二）前处理条件的优化”中“1.pH”方法将样品溶液调至最适pH，以85%无水乙醇除去溶液中低聚糖，合并提取液，定容于100 mL容量瓶备用（液体样品编号SJ—1，固体样品编号SJ—2）。

2.测定波长的选择。分别各取1.0 mL供试液SJ—1、供试液SJ—2、没食子酸标准溶液加入25 mL刻度试管中，依次加入5.0 mL 10%Folin—Ciocalteu试剂振荡反应3～5 min、4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，混匀，室温超声至体系内不再产生气泡，超纯水定容。室温下避光放置60 min，用1 cm比色皿于600～850 nm波长范围内测定吸光值，绘制呈色化合物的吸收曲线，确定最佳测定波长。

3.呈色反应体系中各试剂用量的确定。7.5%Na2CO3溶液：移取SJ—1、SJ—2供试液各1.0 mL分别于8支25 mL刻度试管内，各加10%Folin—Ciocalteu试剂5.0 mL，摇匀，各加入不同体积（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL）的7.5%Na2CO3溶液，室温超声至体系内不再产生气泡后，超纯水定容。室温避光下完成显色反应，测定其吸光值，确定7.5%Na2CO3溶液的最佳用量。

10%Folin—Ciocalteu试剂：方法同上，加入梯度10%Folin—Ciocalteu试剂（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL），确定10%Folin—Ciocalteu试剂的最佳用量。

4.稳定性试验。按照上述最佳反应条件，考察供试液SJ—1、SJ—2反应时间 （10、20、30、60、90、120 min）和显色温度（5、10、20、30、40、50℃）对吸光值的影响。

5.标准曲线的绘制。用移液管分别移取（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL）的没食子酸标准储备液于100 mL容量瓶中，分别用超纯水定容至刻度，摇匀。从上述溶液中各吸取1.0 mL分别加入25 mL刻度试管内，各加7.0 mL 10%Folin—Ciocalteu试剂振荡反应3～5 min，再加5.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，混匀后室温超声至反应体系内不再产生气泡，超纯水定容。于30℃下避光静置反应90 min，以超纯水为空白，于最佳波长处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，得出标准曲线y＝0.004 1x—0.001 4，R2＝0.999 6。

6.数据分析。液体样品中多酚含量根据公式（1）计算，固体样品中多酚含量根据公式（2）计算。同一样品两次测定值的绝对差值不得超过算数平均值的10%，取两次测定的算数平均值作为结果，保留小数点后两位。方法检出限为0.03 mg/kg。

公式（1）、公式（2）中，X为多酚含量 （mg/g）；A为样品测试液吸光度；A0为试剂空白液吸光度；V为样品溶液体积，100 mL；d为稀释因子（通常为1 mL稀释成10 mL，则稀释因子为10）；R为没食子酸标准曲线斜率；m为样品质量（g）；ω为样品干物质含量（%）。

（四）Folin-Ciocalteu比色法精密度试验

1.重现性试验。按照确定的最佳Folin—Ciocalteu比色法反应条件，对供试样品（样品编号为SJ—3、SJ—4）平行测定7次其多酚含量，并计算测定结果的相对标准偏差（RSD，%），考察该方法的重复性[15]。

2.再现性试验。按照确定的最佳Folin-Ciocalteu比色法反应条件，对上述制备的样品供试液（编号为SJ—5、SJ—6）重复测定6次其多酚含量，并计算测定结果的相对标准偏差（RSD，%），考察该方法的再现性[15]。

3.加标回收试验。按照“（三）Folin-Ciocalteu比色法反应条件的优化”中“1.样品制备”方法制备供试液（编号为SJ—7、SJ—8），并在制备供试液中加入不同量的没食子酸标准溶液，以最佳Folin—Ciocalteu比色法反应条件分别测定其多酚含量，并计算其回收率，评价该方法的准确性和可靠性[16]。

（五）方法比对试验采用本文优化的Folin—Ciocalteu比色法（简称方法一）与GB/T 8313—2018中“4茶叶中茶多酚的检测”的方法（简称方法二），在相同试验环境下进行方法比对试验，检测送检留样茶酵素（编号1）、芒果酵素（编号2）、苹果酵素（编号3）、桑葚酵素（编号4）、刺梨复合酵素饮品（编号5）、芦荟酵素（编号6）中的多酚含量，以验证本方法的准确性、可靠性。

二、结果与讨论

（一）前处理条件的确定

1.pH。植物源性多酚以自由酚和结合酚两种形式存在，大多数为结合酚，pH是影响酚类物质与蛋白质、多糖间发生非共价相互作用的重要因素[17～19]。因此，样品预处理前有必要考察pH对其测定结果的影响，结果见表1。

表1 pH对吸光度的影响 （n＝3）

由表1可以看出，样品前处理pH在3.0～8.0之间，所测吸光值随pH的上升而逐渐降低，是由于随着pH上升，多酚类物质与蛋白质、多糖等复合被沉降[19～20]，造成检测结果下降。通过对所测吸光值进行显著性差异分析发现，液体样品pH在3.0、4.0、5.0，固体样品pH在3.0、4.0时吸光值不存在显著性差异（P＞0.05）；液体样品和固体样品pH在6.0、7.0、8.0时吸光值存在显著性差异（P＜0.05）。得出结论，样品前处理pH对茶酵素产品多酚含量测定影响显著，故确定样品前处理最佳pH≤4.0。

2.低聚糖。低聚糖对吸光度的影响如表2所示，由结果可见，通过醇沉法除去低聚糖成分后吸光值显著降低，固体样品吸光值降低超过50%，液体样品吸光值降低超过30%，存在极显著性差异（P＜0.01），可能是由于添加的低聚异麦芽糖、低聚半乳糖等有自由的醛基，具有一定的还原性所致，因此茶酵素样品在前处理中应除去低聚糖[19]。

表2 低聚糖对吸光度的影响 （n＝3）

（二）Folin-Ciocalteu比色法反应条件的确定

1.测定波长的确定。图1为没食子酸标准溶液和样品溶液（SJ—1、SJ—2）的光谱扫描结果，由结果可以看出，通过扫描600～850 nm范围的吸光值，没食子酸标准品及茶酵素样品在740～760 nm之间有明显的吸收高峰，茶酵素样品最高吸收峰在750 nm处，因此确定750 nm为测定波长。

图1 标准溶液和样品溶液的光谱扫描结果

2.7.5%Na2CO3溶液用量的确定。7.5%Na2CO3溶剂用量对吸光度的影响如表3所示，可以看出，所测吸光值随着7.5%Na2CO3溶液用量的增加呈现先升高后降低的趋势，用量为5.0 mL时吸光值最高，且SJ—1、SJ—2样品测定结果变化基本一致。是由于Folin-Ciocalteu试剂与多酚物质在碱性环境下显色反应，7.5%Na2CO3溶液用量不足，显色不完全，会导致所测吸光度偏低。通过对所测各吸光值进行显著性差异分析可得，7.5%Na2CO3溶液用量为5.0 mL和6.0 mL时吸光值均高于其他用量时，且均存在显著性差异（P＜0.05），7.5%Na2CO3溶液用量为5.0 mL的吸光值最高，因此确定7.5%Na2CO3溶液最佳用量体积为5.0 mL。

表3 7.5%Na2CO3溶液用量对吸光度的影响 （n＝3）

3.10%Folin—Ciocalteu试剂用量的确定。10%Folin—Ciocalteu试剂用量对吸光度的影响如表4所示，可以看出，吸光值随着10%Folin—Ciocalteu试剂用量的增加而增加，在用量6.0 mL时趋于稳定，是由于随着Folin—Ciocalteu试剂用量的增加，显色反应越完全。进行显著性差异分析SJ—1、SJ—2样品所测吸光值，得出10%Folin—Ciocalteu试剂用量为6.0 mL时的吸光值与用量2.0、3.0、4.0、5.0 mL的吸光值存在显著性差异（P＜0.05），用量7.0 mL相比6.0、8.0 mL无显著性差异（P＞0.05），故确定10%Folin—Ciocalteu试剂最佳用量体积为7.0 mL。

表4 10%Folin-Ciocalteu试剂用量对吸光度的影响 （n＝3）

4.稳定性试验。显色温度和反应时间对供试液SJ—1、SJ—2吸光度的影响分别如表5、表6所示，可以得出，SJ—1在5、10、20℃，SJ—2在5、10℃显色温度条件下，随着反应时间（10～120 min）的增加，吸光值基本保持持续升高趋势，这是由于反应温度过低会降低反应速率；SJ—1、SJ—2在40、50℃显色温度条件下，呈现吸光值增速快、最高吸光值相对偏低、反应时间超过60 min后吸光值明显下降等现象，这是因为显色温度较高时多酚氧化速度加快，Folin—Ciocalteu试剂开始分解，从而导致所测吸光值降低或结果不稳定的现象[16]；SJ—1在显色温度为30℃，显色反应至90 min时吸光值趋于平稳状态，SJ—2在显色温度为20、30℃，显色反应至90 min时吸光值趋于平稳状态。通过对吸光值结果进行显著性差异分析得出，显色温度为30℃时，90、120 min吸光值不存在显著性差异（P＞0.05）。为便于检测、缩短反应时间，高效达到显色效果，故选择显色温度为30℃，避光反应90 min。

表5 显色温度、反应时间对供试液SJ-1吸光度的影响 （n＝3）

表6 显色温度、反应时间对供试液SJ-2吸光度的影响 （n＝3）

（三）精密度试验

1.重现性试验。采用优化后的测定方法分别对SJ—3、SJ—4供试液平行测定7次其多酚含量，结果见表7。由表7可得出，SJ—3试样RSD为0.93%，SJ—4试样RSD为1.14%，均＜1.5%，重现性良好。

表7 重现性试验结果

2.再现性试验。采用优化后的测定方法分别平行测定6次SJ—5、SJ—6样品中多酚的含量，结果见表8。由表8可得出，SJ—5试样RSD为0.49%，SJ—6试样RSD为0.83%，均＜1.5%，精密度完全满足样品分析的要求。

表8 再现性试验结果

3.加标回收试验。采用优化后的测定方法进行加标回收试验，结果见表9。由表9可知，SJ—7、SJ—8样品5次加标回收试验的最低回收率分别为97.6%、94.2%，最高回收率分别为101.7%、98.1%，平均回收率分别是98.8%、96.6%，其RSD分别为1.69%、1.68%，均＜2.0%，表明该优化后的方法检测准确可靠。

表9 加标回收率试验结果

4.方法比对试验。通过本法与国家标准GB/T 8313—2018方法比对测定送检留样酵素产品中的多酚含量，结果见表10。结果显示，国标法测定结果值明显高于本法，存在显著性差异（P＜0.05）。国标法测定结果值的RSD均＞2.0%，本法测定结果值的RSD均＜2.0%。因酵素产品中含有大量的低聚糖及各产品pH的不同，显著影响了检测结果，导致结果偏高及RSD＞2.0%。因此，国标法并不适用于酵素产品中多酚含量的测定，采用本法测定酵素产品中的多酚含量更具准确性、可靠性。

表10 方法比对试验结果 （n＝3）

三、结论

本研究确定了茶酵素产品中多酚含量测定的Folin—Ciocalteu比色法前处理及最佳反应条件。前处理条件为：样品溶液调至pH≤4.0，去除低聚糖。最佳反应条件为：10%Folin-Ciocalteu试剂7.0 mL、7.5%Na2CO3溶液5.0 mL、温度30℃、避光反应90 min，最佳测定波长750 nm。没食子酸标准溶液在5～50μg/mL浓度的范围内与吸光度有良好的线性关系，相关系数为R2＝0.999 6。精密度试验结果表明，液体和固体供试样品精密度试验RSD均＜1.5%，平均加标回收率分别是98.8%、96.6%，其RSD分别是1.69、1.68%，均＜2.0%。通过与国标法比对检测，说明国标法并不适用于酵素产品中多酚含量的测定，采用本法测定酵素产品中的多酚含量简单方便、稳定性好、精密度高、结果准确可信，可有效用于酵素产品中多酚含量检测。