超高效液相色谱-串联质谱法测定克氏原螯虾和养殖水体中双唑草腈残留

倪建秀 陈琳琳 李文杰 陈 涛 陈桂芳

（南京市农产品质量检测院，南京 210036）

我国水产养殖产量保持稳定增长，2020年全国水产品养殖产量为5 224.20万t，同比增长2.86%[1]。由于农业生产过程中不可避免需要使用农药进行除杂和防治病害，农药对环境造成的污染也成了我国影响范围最大的一种有机污染[2]。农药在田间使用后，部分经雨水的冲刷、河流的搬运等进入环境中[3]，进而污染养殖水体，因此，农药残留是水产品质量安全的风险点之一，研究建立水产品和养殖水体中农药残留检测方法具有重要的意义。

双唑草腈是双吡唑类除草剂。2018年湖北相和精密化学有限公司开发的97%双唑草腈原药和2%双唑草腈颗粒剂在我国首先获得登记，制剂登记用于防除水稻移栽田一年生杂草[4]，以双唑草腈为代表的PPO抑制剂类除草剂成为解决对磺酰脲类除草剂产生抗性的杂草的非常有潜力的品种[5]。目前，国内外对双唑草腈残留检测方法研究较少，有液相色谱—串联质谱（LC—MS/MS）法测定环境[6～7]、水稻[8～10]中双唑草腈残留，气相色谱—串联质谱（GC—MS/MS）法测定豇豆[11]中双唑草腈残留等，而对水产品中双唑草腈残留的检测研究尚未见报道。本文以克氏原螯虾和养殖水体为代表，利用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC—MS/MS）建立克氏原螯虾和养殖水体中双唑草腈残留检测方法。

一、 材料与方法

（一）试剂与材料双唑草腈标准品购自德国DR.E公司，纯度99.8%；乙腈、正己烷为色谱纯（TEDIA公司）；实验室用水为Milli—Q超纯水；克氏原螯虾和养殖水体为南京市地产水产品和养殖水体。

（二）仪器与设备6460C超高效液相色谱—三重四极杆串联质谱仪（配有ESI离子源，Agilent公司）；SQPQ65—1CN电子天平，感量0.000 01g（赛多利斯公司）；KS 501振荡器（IKA公司）；Avanti J—E高速冷冻离心机（贝克曼公司）；MS3涡旋混合器（IKA公司）；MV5全自动平行浓缩仪（莱伯泰科公司）；0.45μm GHP万用膜针式过滤器（美国Pall公司）。

（三）试验设计

1.标准溶液的配制。准确称取适量的双唑草腈标准品，用乙腈配制成100μg/mL的标准贮备液，再用流动相稀释成相应的标准工作液。

2.样品前处理。（1）采样和试样制备：抽取有代表性克氏原螯虾，至少取10只清洗后，去虾头、虾皮、肠腺得到整条虾肉，进行绞碎混合均匀后（不少于200 g）备用。采集的养殖水样经0.45μm混合纤维素滤膜过滤。如水样较浑浊，可更换滤膜或过滤2次。过滤后的水样4℃密封保存，并尽快检测。（2）克氏原螯虾样品提取和净化：称取5.00 g（精确至0.01 g）试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL乙腈，于涡旋混合器上混合1 min后振荡10 min，再在4℃条件下以10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液加到15 mL离心管中，上清液在40℃水浴中氮吹至近干。用1 mL流动相溶解，加入2 mL正己烷，于涡旋混合器上混合1 min后，4 000 r/min离心10 min，取下层溶液过0.45μm滤膜，供UPLC—MS/MS测定。（3）水样提取和净化：准确量取已制备的水样5 mL于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL乙腈，于涡旋混合器上混合1 min后振荡10 min，再加入1 g NaCl，于涡旋混合器上混合1 min，之后在4℃条件下以10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液加入含有4 g Na2SO4的15 mL离心管中，于涡旋混合器上混合1 min后振荡10 min，再以4 000 r/min离心5 min。将上清液于40℃水浴中氮吹至近干，用1 mL流动相溶解，过0.45μm滤膜，供UPLC—MS/MS测定。

3.色谱条件。色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8μm）；流动相为乙腈—0.1%甲酸水溶液（55/45，V/V）；进样体积10μL；流速0.4 mL/min；柱温为30℃。

4.质谱条件。电喷雾离子源ESI；雾化气：氮气；离子喷雾电压：4 000 V；干燥气温度：350℃；干燥气流速：11 L/min；雾化气压力：45 psi；扫描方式：多反应监测MRM。其他参数见表1。

表1 双唑草腈色谱保留时间和MRM质谱参数

二、结果与讨论

（一）色谱条件的优化在流动相中添加甲酸或乙酸，可以提高双唑草腈的离子化效率，提高正离子模式扫描下的响应强度。参考张月等的[9]方法，以双唑草腈标准溶液为对象，分别考察乙腈—水、乙腈—0.1%甲酸水溶液和乙腈—0.2%甲酸水溶液作为流动相，对目标分析物色谱分离效果的影响。结果表明，采用3种流动相均能得到良好的峰形，响应强度差异不显著（p＞0.05）。当乙腈中加入0.1%甲酸水溶液后，重复性更好，本实验最终选择乙腈—0.1%甲酸水溶液作为流动相。在此条件下，目标物在5 min前出峰，有效控制分析时间，节约流动相使用量。0.5 ng/mL双唑草腈标准溶液色谱图如图1所示。

图1 0.5 ng/mL双唑草腈标准溶液的色谱图

（二）质谱参数的优化选择scan模式，采用ESI离子源正离子模式对浓度1 mg/L的双唑草腈标准溶液进行扫描，确定其分子离子峰为m/z315.1。然后以此分子离子作为母离子，在相对分子质量70～350范围内进行子离子全扫描，选择其中响应水平较高且干扰较小的2个子离子分别作为定量离子和定性离子。最后对离子碰撞能量等参数进一步优化，最终确定的质谱参数见表1。

（三）提取条件的优化常用的提取剂有乙腈—水—缓冲液、乙腈—水—酸、甲醇—水—酸等溶剂。甲醇提取时会带入更多的极性基质干扰物，且蛋白沉淀松散，增加后续净化难度[12～13]。双唑草腈为弱酸性化合物，在酸性条件下可保持分子形态，因此本研究选择乙腈、0.1%酸化乙腈、0.2%酸化乙腈溶液作为提取液，在空白基质中添加2.5 μg/kg双唑草腈后分析。结果显示，3种提取剂均取得良好的结果，可能由于双唑草腈结构较稳定，对微弱酸碱环境不敏感，导致对最终提取效率影响不大。考虑到乙腈作为提取剂试剂种类更少，最终确定乙腈为提取剂。但需注意，因乙腈有快速蛋白沉淀效果，向样品中加入乙腈后会使样品表面变性结块，导致样品无法被乙腈充分分散和振荡提取，因此样品加入提取剂乙腈后应尽快剧烈振荡。

（四）净化条件的优化因养殖水体基质相对简单，不用净化，本研究重点对基质相对复杂的克氏原螯虾提取液进行了净化条件的优化。目前，分散固相萃取（DSPE）净化[14]是常用的净化方法之一，其中氨基型吸附剂（如—NH2、PSA）具有弱阴离子交换能力，通过氢键和化合物作用，可除去碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和少量色素。C18吸附剂作为净化剂，是在硅胶基质上接有十八烷基，具有较高的相覆盖率和碳含量，可去除脂肪和脂类等非极性干扰物。MgSO4和Na2SO4为常用吸水剂，因Mg的螯合性，MgSO4的使用对许多化合物的回收率有负面影响，用Na2SO4替代MgSO4可以有效地吸收水分[15～16]。本研究在空白克氏原螯虾提取液中添加2.5μg/kg双唑草腈，分别考察了50 mg PSA+150 mg C18+900 mg Na2SO4作为净化剂净化，和正己烷液液分配法净化，对目标分析物回收率的影响。结果表明，两种净化方法回收率均在80%～100%范围内，因此选择在流动相溶解残渣后，加入2 mL正己烷混匀，以4 000 r/min离心10 min，取下层溶液过0.45μm滤膜，供UPLC—MS/MS测定。

（五）基质效应的考察未被去除的基质共提取物对分析物的干扰，会影响测定结果的准确性，需要考察基质效应。本研究基质效应ME采用“（基质标准曲线的斜率／溶剂标准曲线的斜率—1）×100%”进行评价，负值表示存在基质抑制效应，正值表示存在基质增强效应，当—20%＜ME＜20%时为弱基质效应；当—50%＜ME≤—20%或20%≤ME＜50%时为中等基质效应；当ME≤—50%或ME≥50%时为强基质效应[17]。基质效应影响大时，会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性，甚至使检测结果产生较大的误差。本研究中，分别用克氏原螯虾样品、水样空白上机液和流动相，配制0.5、1、5、10和50μg/L的标准溶液，进行上机测定，并绘制标准工作曲线。结果表明，克氏原螯虾样品和水样的基质效应ME分别为—15.0%和—6.4%，为弱基质抑制效应，因此，采用流动相配制的标准曲线即可满足定量检测要求。

（六）方法的线性范围、线性关系和定量限精密量取一定体积的标准工作液，用流动相定容，配制质量浓度为0.5、1、5、10和50μg/L的双唑草腈标准溶液，按上文检测方法进行分析，以色谱峰面积（y）对其质量浓度（x，μg/L）绘制标准工作曲线。结果显示，在0.5～50μg/L范围内，双唑草腈线性关系良好，相关系数（R2）＞0.999 8，线性方程为y＝2 165.077 9x—136.272 6。

方法定量限（LOQ）通过在空白基质中添加一定标准溶液，按照上文选择的前处理方法和条件进行分析，以10倍信噪比作为定量限。该方法测定克氏原螯虾中双唑草腈的定量限为0.5μg/kg，测定水体中双唑草腈定量限为0.5μg/L。

（七）方法的正确度和精密度向空白试样中添加质量浓度是定量限1倍、5倍、20倍的双唑草腈标准工作液，每个添加浓度重复6次，计算添加回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表2。结果显示，克氏原螯虾中双唑草腈在0.5、2.5、10 μg/kg 3个加标水平上回收率为83.6%～92.3%，相对标准偏差为7.6%～11.4%；水样在0.5、2.5、10μg/L 3个加标水平上回收率为96.4%～101.3%，相对标准偏差为1.5%～2.8%。结果符合GB/T 32465—2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》中对正确度和精密度的要求[18]。

表2 克氏原螯虾和水体中双唑草腈的加标回收率及相对标准偏差 （n＝6）

（八）实际样品的检测应用本文所建立的方法对本地抽取的30份克氏原螯虾和20份养殖水体中的双唑草腈进行检测，并同时由质控人员向空白基质中添加目标分析物进行盲样添加试验。最终结果显示，所有样品均未检出双唑草腈，盲样检测回收率与正确度试验结果相符合，说明该方法适用于克氏原螯虾和养殖水体中双唑草腈检测。

三、结论

本研究建立了UPLC—MS/MS测定克氏原螯虾和养殖水体中双唑草腈残留的快速检测方法。克氏原螯虾样品经乙腈提取，正己烷去脂后进行仪器检测；水样经乙腈提取后进行仪器检测。该方法操作简便、快速，结果稳定，可用于克氏原螯虾和养殖水体中双唑草腈残留的快速筛查与定量检测。