影响禽流感HA/HI试验结果准确性的因素分析及纠正措施

刘青彦，张艳娜，宋智慧，吕文君

（河南省舞钢市动物疫病预防控制中心，河南 舞钢 462599）

高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A 型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病，禽流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性，因此，禽流感抗体可以通过HA/HI（血凝/血凝抑制）试验来检测。笔者在多年的检测工作中分析了一系列影响HA/HI 试验结果准确性的因素。现将这些因素加以总结，概述如下，希望为从事兽医实验室检测的从业者提供参考。

1 影响HA/HI试验结果准确性的因素分析

1.1 待检样品不合格

样品在采集、运输、保存等环节疏漏，导致样品腐败、溶血被污染或样品编号弄混。

1.2 PBS液不合格

PBS液pH值在7.2时红细胞沉降最好，所以PBS液一定要用盐酸或氢氧化钠溶液调pH 值至7.2。PBS 液最好现用现配，通常以新开启的生理盐水代替PBS 液，也基本可避免这些情况。

1.3 1%红细胞不合格

①1%红细胞并非来自未经免疫的健康公鸡；②制作1%红细胞的某一环节（采集、洗涤过程中或盛装容器不干净）被污染造成非特异性免疫，影响试验结果；③红细胞在洗涤过程中，离心机转速设置过高，导致红细胞因强大离心力而被压挤破坏；④配制1%红细胞时把本该用的PBS液错用成蒸馏水，导致红细胞因渗透压差而崩解破坏。

1.4 HA试验操作不当等导致抗原效价测定不准确

①滴加抗原到反应板上时滴头未润湿导致抗原效价偏低，从而导致测得结果偏高；②滴头深入抗原液面下过深，抗原倍比稀释时又未更换滴头，从而导致测得抗原效价偏高，因而测得待检血清抗体偏低；③在抗原倍比稀释过程中移液器未插入液面下，导致气泡产生；④1%红细胞不合格；⑤已测过效价的抗原再次使用时直接按原来的效价配制4单位抗原，导致4单位抗原浓度偏低，从而使测得抗体效价偏高（每次试验都需重新测定抗原效价）；⑥滴加红细胞前未将其摇匀；⑦反应时间过短，结果出现太慢，或反应时间太长，或温度太高导致红细胞解凝，影响结果观察（温度最好控制在20～25 ℃，反应时间在30 min左右）。

1.5 计算错误导致所配4HAU抗原不准

虽然测得的抗原效价准确，但因计算错误或者虽计算正确但配制环节中出错都可能导致所配制的4HAU 抗原不准。

1.6 HI试验过程操作不当等方面原因

①因血清倍比稀释过程中滴头未插入液面下导致气泡产生或吹吸次数过少，混合不均匀；②血清倍比稀释过程中因用多道移液器未注意到个别滴头是否松动导致吸液量不够，或者样品呈果冻样无法吸取；③滴加4HAU 抗原时因操作不熟练导致跳孔、串孔及液滴儿飞溅；④再加另一种样品时未更换滴头；⑤滴加4HAU 抗原或红细胞后未立即震荡混匀，或震荡时间过长；⑥未按操作规程，导致加样顺序错误（即滴加抗原和滴加红细胞顺序颠倒）；⑦滴加红细胞前未将其摇匀；⑧反应时间过长或温度过高导致已凝集的红细胞解凝。

2 纠正措施

进行4HAU抗原校正，其方法如下：①在反应板的1～4孔内加入25 ul的生理盐水；②吸取25 ul 4HAU抗原加入第一孔，然后倍比稀释到第4孔；③再吸入25 ul 1%鸡红细胞悬液依次加入1～4 孔；④在微量振荡器上振荡1 min，混合均匀；⑤室温静置30 min后观察结果；⑥结果观察：第1孔、第2孔完全凝集，第3孔红细胞50%沉淀，第4孔完全沉淀，说明所配4HAU 抗原准确，校正成立。但如果出现第2 孔红细胞50%沉淀，则说明所配的4HAU 抗原浓度低一倍，这时需再向所配的4HAU抗原溶液中添加一倍量的抗原。如果出现第4 孔红细胞50%沉淀，则说明所配的4HAU 抗原浓度高一倍，这时需再向所配的4HAU 抗原溶液中添加一倍量的PBS液，不过这可能导致4HAU配得太多而造成浪费。一般建议先少量配制，根据校正结果再适量配制。4HAU抗原校正可谓是验证所配4HAU（浓度）是否准确的“定海神针”。□