链格孢霉毒素样品处理及分析方法研究进展

王昌钊，乔蓉霞，李子豪，林芳

(1.西安海关技术中心，西安 710068； 2.陕西省食品药品检验研究院，西安 710065)

链格孢霉，又名交链孢霉，是一类在自然环境中广泛分布的真菌，具有腐生、内生和植物致病性[1-2]，能引起如烟草赤星病、马铃薯早疫病等多种经济植物病害，也是导致水果、蔬菜及冷藏食品腐败变质的主要微生物[3]。链格孢霉毒素是链格孢霉在适宜条件下产生的小分子代谢产物，目前已知具有明显毒性的有70 多种，根据化学结构的不同，可以将其分为5 种不同的类型：(1)二苯并吡喃酮类，典型有链格(交链)孢酚(AOH)、链格(交链)孢酚单甲醚(AME)；(2)四氨基酸衍生物类，典型有如细交链孢菌酮酸(TeA)；(3)苝醌类，典型有链格(交链)孢毒素(ATXs)；(4)混杂结构，典型有腾毒素(TEN)；(5)长链氨基多元醇的丙三羧酸酯类，典型有番茄交链孢菌毒素(AAL)。苹果、柑橘、番茄、萝卜、高粱、小麦等果蔬和谷物及饲料，均可在田间、运输或冷藏环境下受到真菌的污染而腐败，继而产生并累积上述链格孢霉毒素[4]。

杨胜利等[5]调查了林县居民粮食中互隔交链孢霉污染情况及人群中AOH 和AME 暴露水平，结果显示2004 年河南林县居民粮食中互隔交链孢霉及其相关毒素污染状况有不同程度的减轻，此与当地食管癌发生率的降低可能有一定的关系。2016～2018 年国家食品污染物监测显示小麦及其制品中TeA 和TEN 的污染严重，检出率超过90%[6]。陈蓓等[7]对江苏省内小麦粉中4 种交链孢毒素污染情况进行调查，在105 份小麦粉样品中，TeA、AOH、TEN 检出率为100%，AME 检出率为88%。链格孢霉毒素对人或牲畜具有诱变性、致癌性和致畸性等慢性或急性毒性作用[8-9]，其中TeA 急性毒性相对较高，被美国食品药物管理局列入有毒化学物质登记册中，巴伐利亚规定了高粱和小米等婴儿食品中的TeA 限量标准为500 μg/kg[10]。在我国食品污染和有害因素风险监测及进出口商品风险监测项目中，链格孢霉毒素也列入监测范围，目前已有发布实施的地方标准，行业标准也在制定中。近年来随着研究不断深入，链格孢霉毒素的危害和污染现状引起各个国家的重视，笔者总结了近几年链格孢霉毒素样品处理方法和检测技术研究进展。

1 样品处理方法

样品处理技术是获得准确、可靠检测结果的前提和保障，样品处理过程包括样品制备、提取、分离纯化和浓缩等步骤，以最大程度地从复杂基质中提取待测组分为目的。链格孢霉毒素的样品处理(净化与富集)方法主要有液液萃取技术[11]、固相萃取(SPE)技术[12]、逆流色谱法(CCC)[13]、基于QuEChERS 原则的处理技术[14]等。在固相萃取(SPE)技术的基础上，发展了分散固相萃取(dSPE)法、分子印迹固相萃取(MISPE)法。

1.1 液液萃取技术

液液萃取法是基于杂质和待测物在不同溶剂中溶解度的差异来完成萃取净化，根据相似相容原理，链格孢霉毒素的提取一般使用甲醇、乙腈等试剂。液液萃取技术具有简单快速、易于实现、操作快速等特点，但存在有机溶剂用量大、不能满足高通量检测需求、目标物易流失等问题[15]。

ZHOU Jian 等[16]首次将分散液液微萃取技术用于谷物中5 种链格孢霉毒素的提取。利用基于QuEChERS 原则的处理技术提取并盐析后，将上清液进行分散液液微萃取(DLLME)，然后使用光电二极管阵列/荧光检测器联用的超高效液相色谱仪和超高效液相色谱-串联质谱仪同时测定谷物中的AOH、AME、ALT、TEN、TeA 5 种链格孢霉毒素，定量限为2.1～120.0 μg/kg，加标回收率为72.7%～109.1%，测定结果的相对标准偏差为0.47%～9.62% (n=6)。PUNTSCHER 等[17]利 用 甲醇-水-甲酸(体积比为79∶20∶1)溶液提取番茄酱、葵花籽油和小麦粉中天然存在的17 种游离和修饰型的链格孢霉毒素，为了降低葵花籽油的黏度、提升样品的均匀性和萃取效率，振荡前在葵花籽油样品中加入正己烷，去除葵花籽油样品中正己烷层后，使用甲醇-水(体积比为10∶90)稀释萃取液，经离心、滤膜过滤后使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定。该方法检出限为0.03～9.00 μg/kg，定量限为0.60～18.00 μg/kg，AOH-3-硫酸盐、AME-3-硫酸盐、细格菌素等在小麦粉中的加标回收率低于70%，其它链格孢霉毒素的加标回收率为75%～100%，该方法测定结果稳定且可重复。PUNTSCHER 等[18]利用甲醇-水-甲酸(体积比为79∶20∶1)溶液提取苹果样品中ATX II 等17 种游离和修饰型的链格孢霉毒素，上层液使用甲醇-水(体积比为10∶90)稀释，离心后经LC-MS/MS法测定，首次测定了苹果样品中具有高遗传毒性的ATX II。

1.2 固相萃取技术

固相萃取是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使样品中的基体和干扰物分离，然后经洗脱剂洗脱，从而使目标化合物得到分离和富集。相比于液液萃取，固相萃取法简化了样品前处理步骤，降低了有机试剂的消耗。其中真菌毒素免疫亲合固相萃取柱的使用，大大降低了基体干扰，提高了样品净化度。但免疫亲和固相萃取方法只能针对一种或一类真菌毒素进行净化，无法应用在高通量检测中。近年来，新型材料包括碳基纳米材料、生物材料和高分子聚合物材料的发展促进了固相萃取技术在链格孢霉毒素样品处理中的应用。

TANVEER 等[19]以还原型氧化石墨烯-氧化锌(rGO-ZnO)纳米复合材料作为分散固相萃取吸附剂，同时富集和纯化黄连中AME 等12 种真菌毒素，研究了影响分散固相萃取方法性能的关键参数，以乙腈-水-甲酸(体积比为80∶19∶1)溶液作为萃取溶液，以2%乙腈溶液作为吸附液，15 mg rGOZnO 作为吸附剂，正己烷作为洗脱液，1%甲酸-甲醇溶液作为解吸液进行纯化和富集，使用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)法进行分析，其标准曲线的相关系数均大于0.995，定量限为0.09～0.41 μg/kg，加标回收率为70.3%～105.7%，测定结果的相对标准偏差为1.4%～15.0% (n=6)。

RICO-YUSTE 等[20]合成了对AOH、AME 有选择性的分子印迹多孔聚合物微球体，用于食品样品中AOH、AME 的提取。使用4-乙烯基吡啶(VIPY)和甲基丙烯酰胺(MAM)作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)作为交联剂，3，8，9-三羟基-6H-二苯并[b，d]吡喃-6-酮(S2)作为链格孢酚替代模板，经优化后的MISPE 法选择性分离链格孢霉毒素，使用高效液相色谱法或串联质谱法进行分析。根据欧洲委员会第2002/657/EC 号决议，MISPE 法已通过UPLC-MS/MS 法验证，用于番茄汁和香油中AOH 和AME 的测定，其定量限为1.1～2.8 μg/kg，加标回收率为92.5%～106.2%。

ABOU-HANY 等[21]制备了多孔分子印迹聚合物微球，可选择性地键合AOH，在二苯并[b，d]吡喃-6-酮骨架上的不同位置具有不同数量的酚基团和不同程度的O-甲基化。

碱性、酸性或中性单体混合物，以二乙烯基苯或乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在毒素分子的4 种分子模拟物存在下聚合，通过筛选确定微珠的最佳组分为N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯。经优化的MISPE 法分离，使用配有荧光检测器的液相色谱仪测定了番茄样品中添加的5 种浓度水平(33～110 μg/kg)的AOH，加标回收率为81%～103%。

1.3 逆流色谱法

逆流色谱技术(CCC)是当前分离技术的一个热点，已在世界范围内得到了推广应用。FAN Chen等[13]使用分析型逆流色谱仪，在优化的CCC 操作条件下，使用两相溶剂系统开发了一种使用逆流色谱法进行富集和净化链格孢霉毒素的样品处理方法，最后经高效液相色谱分析。样品中的AOH、AME 和TeA 被提取并富集在固定相中，然后将固定相作为流动相反方向在线完成洗脱，富集因子为87～114，加标回收率为81.14%～110.94%。用该方法检测苹果汁和葡萄酒样品中的链格孢霉毒素的检出限为0.03～0.14 μg/L。

1.4 基于QuEChERS 原则的样品处理方法

传统固相萃取净化法操作过程繁琐、耗时长，分析成本较高，不能同时净化多种真菌毒素。而依据QuEChERS 原则的样品处理方法，利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用吸附杂质，从而达到除杂净化的目的。由于多种净化填料组合可以高效去除多种杂质，且操作简便快速，溶剂用量少，精确度和准确度高，适用的真菌毒素范围广，QuEChERS 成为目前真菌毒素分析应用较多的样品处理原则[22]。

BERARDIS 等[23]采用基于QuEChERS 原则的处理方法，开发了液相色谱-串联质谱法测定番茄和水果产品中的AOH、AME、TEN 和TeA 4 种链格孢霉毒素，其标准曲线的相关系数均大于0.998，测定结果的相对标准偏差小于10%。在番茄和水果产品中，TeA 的加标回收率为98.8%～108.9%。应用该方法测定了从意大利市场收集的57 个番茄和水果样品，在部分样品中检出了TeA，其中在番茄酱中检出TeA 高达814 μg/kg。

周贻兵等[24]根据QuEChERS 原则对番茄样品进行处理。首先加入酸化乙腈，超声提取30 min，用于提取AOH、AME、ALT、TEN 和TeA 5 种链格孢霉毒素，随后加入0.5 g 氯化钠和5 g 无水硫酸镁，脱水后离心，在提取液中加入25 mg C18作为净化剂除去色素等共提取物。ZHENG Ruihang 等[25]基于QuEChERS 原则优化了处理方法，样品经水和1.5%甲酸-乙腈溶液萃取，然后经氯化钠盐析提取净化样品，使用高效液相色谱-串联质谱法测定了混合果泥中细交TeA、AOH、AME、ALT、TEN、ALS 和ATX-Ⅰ7 种链格孢霉毒素。结果表明，7 种链格孢霉毒素的质量浓度在0.5～200.0 μg/L 范围内线性良好，相关系数均大于0.996，平均加标回收率为79.5%～106.7%。

2 分析方法

食品中链格孢菌毒素的检测方法主要有薄层色谱(TLC)法[26]、气相色谱(GC)法[27]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[28]、高效液相色谱(HPLC)法[29]、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法[30]、酶联免疫(ELISA)法[31]等。其中色谱-质谱联用分析法和免疫分析法成为链格孢菌毒素色谱检测的主要方法。近年来发展的新型分析方法包括加压毛细管电色谱法、组合表面增强拉曼光谱法在链格孢霉毒素分析中也得到了应用，大大提高了链格孢霉毒素分析的灵敏度。

2.1 液相色谱-质谱联用法

LC-MS/MS 法具有选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强以及优良的定性鉴定能力，可使样品处理过程得到简化，在真菌毒素的高通量检测方面具有明显优势，成为目前链格孢霉毒素最常用的检测方法。

XING Lijie 等[32]优化了样品预处理条件，包括稀释溶剂、萃取溶剂和根据QuEChERS 原则纯化参数，结合超高效液相色谱-串联质谱法，采用正电喷雾离子源，在多反应监测(MRM)模式下同时测定TeA、AOH、AME、ALT、TEN 5 种链格孢霉毒素，5种链格孢霉毒素在1～200 μg/L 质量浓度范围内具有良好的线性关系，定量限为0.32～0.77 μg/kg，加标回收率为73.8%～111.5%，测定结果的相对标准偏差小于10% (n=6)。

液相色谱高分辨质谱凭借其超高的质量分辨率和精确相对分子质量的功能，在真菌毒素多组分的筛查与确证中也得到了越来越多的青睐。FAN Yingying 等[33]使用改进的样品处理方法，建立了超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱(UPLC-Q-TOF-HRMS)法测定水果样品中20 种真菌毒素，包括AOH、AME、TeA、TEN、ALT、ATX-1、ATX II 等链格孢霉毒素，其定量限为0.20～7.39 μg/kg，加标回收率为81.2%～99.2%，测定结果的相对标准偏差不大于9.8%。

2.2 加压毛细管电色谱法

加压毛细管电色谱(pCEC)法是近年发展起来的一种新型微分离分析技术，结合了毛细管电泳与液相色谱的优势，通过在填充有高效液相填料的毛细管电色谱柱两端施加高压直流电场，使样品在毛细管色谱柱中的保留行为同时受到电渗流及其在流动相与固定相之间分配系数的影响，大大提高了样品分离能力。薛羚伟等[34]以霉变柑橘为待测样品，建立了同时检测AME、AOH 和ALT 3 种链格孢霉毒素的固相萃取-加压毛细管电色谱(SPE-pCEC)快速检测方法，样品经乙腈提取，无水MgSO4和NaCl 脱水盐析，C18SPE 萃取净化，以C18毛细管色谱柱为分离柱，以含0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，采用荧光检测器分析。该方法质量浓度线性范围为2～200 μg/L，相关系数均大于0.995，检出限为0.1～0.9 μg/kg。

2.3 表面增强拉曼光谱法

表面增强拉曼散射效应是指在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中，在激发区域内，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号大大增强的现象[35]。表面增强拉曼光谱(SERS)技术是一种具有超高灵敏度的指纹光谱技术，由于其无需样品预处理、操作简便、准确率高等特点，目前在电化学、生物医药、环境科学等诸多领域中得到广泛应用。

GUO Zhiming 等[36]提出了一种结合化学计量学和咖啡环效应的SERS 技术，构建了AOH 的高通量无标记检测模型，通过优化干燥温度和液滴体积，构建了稳定的咖啡环结构，检测了苹果中AOH 含量。通过咖啡环富集提高了检测灵敏度，AOH 检出限为1 μg /L，加标回收率为82.06%～108.13%，测定结果的相对标准偏差不大于2.28% (n=5)。SERS技术与化学计量学和咖啡环效应相结合，有望对水果及其产品中的AOH 进行高通量无标记检测。

3 快速检测技术

液相色谱-质谱联用法设备价格昂贵、对人员操作要求较高。同时对于复杂基体的样品，由于共萃物的影响存在基质效应，造成质谱信号的增强或抑制。通常需要采用内标物或基体匹配标准曲线进行校正，以消除基质效应的影响。但同位素内标种类有限且价格昂贵；而基体匹配标准曲线配制费时费力，适用性较差，因此开发一种简单、快速且经济高效的链格孢霉毒素等真菌毒素检测方法引起了越来越多研究者的兴趣。

3.1 酶联免疫法

1971 年Engvall 和Perlmann 将酶联免疫吸附(ELISA)用于免疫球蛋白G (IgG)的定量测定，使酶标抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法。

SINGH 等[37]使用对AOH 有特异性的多克隆抗体，开发了一种间接竞争酶联免疫(ic-ELISA)分析法，用于检测面包和麸皮样品中的AOH，面包中的检出限为(2.4±0.6) μg/kg，半数抑制浓度(IC50)为(15.2±2.6) μg/kg；麸皮提取物中的检出限为(8.4±1.2) μg/kg，半数抑制浓度(IC50)为(52.8±10.8) μg/kg。该方法对AOH 具有非常高的特异性，回收率均大于75%，其检测结果与质谱法获得的结果相当，该方法适用于面包和麸皮样品中AOH 的快速检测。WANG Jianyi 等[38]建立了一种新型的基于半抗原和单克隆抗体的ic-ELISA法，用于同时分析小麦中的AOH 和AME。AOH与4-溴丁酸乙酯发生烷基化反应，水解纯化后与血蓝蛋白偶联免疫接种小鼠，成功产生两种单克隆抗体(mAbs)，一种既能识别AOH 又能识别AME，另一种可以特异性识别AOH。mAb 13D8 识别AOH 和AME 半数抑制浓度(IC50)分别为9.4 μg/L和9.7 μg/L。通过mAb 13D8 建立了ic-ELISA 法以同时检测AOH 和AME，其检出限分别为0.7 μg/L 和1.0 μg/L。小麦样品的平均加标回收率为84.5%～107.6%，变异系数小于10%。该方法的检测结果与HPLC-MS/MS 法相同，表明该方法适用于同时测定小麦中AOH 和AME。

LIANG Yifan 等[39]制备了针对TeA 的特异性单克隆抗体，建立了ic-ELISA 法检测TeA，半数抑制浓度(IC50)和检出限分别为18.50 ng/mL 和1.00 ng/mL，在啤酒、苹果汁和葡萄汁中的平均加标回收率为85.0%～120.0%。XIAO Zhili 等[40]用水合肼将异细交链孢菌酮酸(ITeA)衍生化以产生抗原ITeAH，该抗原进一步与乙醛酸反应生成半抗原ITeAHGA，与牛血清白蛋白(BSA)结合后用作免疫原。通过杂交瘤技术制备与ITeAH 选择性结合的高度特异性的单克隆抗体，用于构建异源ic-ELISA法，其半数抑制浓度(IC50)为7.8 μg/L，检出限为0.5 μg/L，食品样品的加标回收率为82.3%～109.8%，该方法与HPLC-MS/MS 方法之间具有良好的相关性，从而证实了ic-ELISA 法在食品样品中ITeA 的筛选和检测中的适用性。

3.2 化学发光免疫分析法

化学发光酶免疫分析时酶反应的底物是发光剂，以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行测定，通过测定光信号的强弱间接反应被测物浓度，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、方法稳定、测定快速等优点[41]。

YAO Chayuan 等[42]以AOH 羧甲基衍生物与载体蛋白作为免疫原，设计并合成了一种新的AOH 半抗原，用于诱导产生高质量的抗AOH 抗体。采用优化后的ic-CLEIA 法检测AOH，具有良好的灵敏度，其检出限为0.068 μg/L，质量浓度线性范围为0.11～1.23 μg/L，果汁和粮谷类样品的平均加标回收率为72.7%～115.8%，变异系数小于14.3%。ic-CLEIA 法分析结果与HPLC-MS/MS 法具有很好的关联性，二者分析结果一致。该方法可以作为检测食品样品中AOH 的一种有效的筛选工具。MAN Yan 等[43]使用金纳米粒子(GNP)开发了一种新型微流体免疫比色法用于指示不同浓度的AME，以及利用紫外光谱和智能手机成像技术监测金纳米粒子的颜色变化。AME-BSA 修饰的磁性纳米粒子(MNPs-BSA-AME)用作捕获探针和快速分离纯化，AME 单克隆抗体修饰的金纳米粒子(GNP-mAb)用作检测探针和信号放大的催化剂。在574 nm 下微流体免疫比色法能够检测出质量浓度为12.5 ng/L 的AME，当AME 质量浓度为200 ng/L 时可以使用智能手机成像技术检测，分析时间少于15 min。通过分析加入AME 的水果样品，紫外光谱、智能手机成像技术的加标回收率分别为91.19%～94.15%和90.63%～93.9%。

3.3 生物传感器技术

生物传感器是指用固定化的生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为敏感元件的传感器。一般根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为免疫传感器、酶传感器、微生物传感器、细胞传感器和组织传感器。目前，对于链格孢霉毒素分析，主要以免疫传感器技术为主，同时使用光敏元件作为信息转换器，利用光学原理工作的光学免疫传感器，是免疫传感器的重要分支。在利用免疫传感器技术时，不同于大分子，低分子质量真菌毒素的检测主要基于竞争性免疫原理，样品中待测物与免疫传感器标记的抗体或抗原竞争数量有限的结合位点，免疫标记信号随着待测物的增加而降低，通过浓度-信号关系，获得待测物的含量水平[44]。基于信号变化机制，真菌毒素检测中常见的光学免疫传感器主要有比色免疫传感器、荧光免疫传感器、电化学发光免疫传感器、表面离子体共振免疫传感器、电化学免疫传感器等[45]。

3.3.1 比色免疫传感器

MAN Yan 等[46]基于磁性纳米粒子(MNP)开发了一种高灵敏性的比色免疫传感器，通过非聚集金纳米粒子(GNP)检测水果中的AME。AMEBSA-Fe3O4MNP 结合物、游离AME 分子与单克隆抗体(mAb)-GNP 结合物通过竞争键合，经磁分离后直接测量未聚集的GNP 上清液的紫外吸光度，其吸收强度与样品中AME 的浓度成正比。在优化条件下，AME 的检出限为0.16 ng/mL，质量浓度线性范围为0.08～0.48 μg/L。该比色免疫传感器与AME 类似物的交叉反应性较低，水果样品的加标回收率为80.6%～90.7%。

3.3.2 荧光免疫传感器

分子印迹聚合物(MIPs)是人工合成的对给定化合物及其结构类似物有着特异选择性的理想材料，其作为一种选择性吸附剂在异构体分离、固相萃取、化学传感器和模拟生物传感器等方面应用十分广泛。RICO YUSTE 等[47]利用含有β-二酮基团的TeA 可作为Eu(III)离子的螯合配体，诱发Eu(III)离子在615 nm 的敏化发光，对食品中的TeA 进行检测。使用烯丙基丙二酸二乙酯或乙酰乙酸烯丙酯作为功能单体，将其以不同的摩尔比与分子模板(TeA)和交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯)混合，制备了系列Eu(III)-分子印迹聚合物作为发光传感器，用于测定大米提取物中的TeA，质量浓度线性范围为1.7～20 mg/L，检出限为0.5 mg/L，并通过HPLC-DAD 进行结果验证。

3.3.3 电化学发光免疫传感器

QUÍLEZ ALBURQUERQUE 等[48]设计了一种能发红光、可聚合、对TeA 敏感的新型钌(II)-联吡啶-2，2'-联咪唑络合物探针，其外围的N—H 基团在水-有机溶剂混合介质中可识别包括TeA 在内的1，3-二羰基化合物的烯醇式结构，当二者结合后，可引起钌(II)的发光强度和发光寿命的降低。该探针含有丙烯酸酯基团，在TeA 存在下可与甲基丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯发生自由基聚合，在200 nm 的二氧化硅核心上形成厚度为9 nm的分子印记聚合物壳，从而得到基于MIP 的发光传感器(SiO2@Ru-MIP)。SiO2@Ru-MIP 纳米复合结构对TeA 的检测响应时间小于5 s，在稳态检测和时间分辨发光检测条件下，该纳米复合结构对TeA的检出限分别为63.8、75.2 μg/L。

3.3.4 基于适配体的光波导生物传感器

基于适配体的传感器，对多种真菌毒素具有优异的识别能力，由于其具有制备简单、响应速度快、灵敏度高、成本低以及易于原位测量等优点，引起了研究人员越来越多的兴趣，在近十年内适配体传感器在食品中真菌毒素检测方面得到了快速发展。适配体对于开发灵敏且快速的适配体传感器具有很大的希望，但其长度过长且难以识别关键结合域(CBD)。WANG Shuo 等[49]设计了第一个用于AOH 检测的适配体传感器，建立了基于缩短和多价适配体的光波导传感器超灵敏和快速检测小麦中AOH 的方法，而且还提供了制备小分子靶标的多价适配体的方法。该研究中，原始59 nt AOH 适配体的5 nt CBD 确认为两个AT 碱基对之间的“C”凸起，将AOH-59 缩短为23 nt 适配体。通过将一个或两个CBD 加入AOH 6C 中获得30 nt 二价适配体B-2-3 (KD=445 nmol/L)和39 nt 三价适配体T-2-3(KD=274 nmol/L)。 基 于AOH 6C、B-2-3- 和T-2-3的光波导适配体传感器具有很低的检出限(S/N=3)，分别为(42±3)、(6±1)、(2±1) fmol/L。以基于AOH 6C 的传感器检测小麦粉中的AOH，其检出限为0.037 μg/kg，是ELISA 法检测得到的检出限的1/20～1/230。

3.4 快速检测试纸和试剂盒

CAI Peiyuan 等[50]筛选出具有高亲和力的TeA特异性IgG 单克隆抗体(McAb)，建立了基于单克隆IgG 的高灵敏铂修饰胶体金免疫检测TeA 的方法，其用于TeA 检测的ic-ELISA 法的半数抑制浓度(IC50) 为2.50 μg/L，检 出 限 为0.17 μg/L。将铂修饰的金纳米粒子(Au @PtNP)优化为Au @Pt0.4NP，并将所得的Au @Pt0.4NP 探针设计为催化沉淀型四甲基联苯胺，目测检测痕量TeA 的检出限为0.39 μg/L，与现有的胶体金试纸条相比，NP-McAb 试纸条的检测灵敏度大大提高。所开发的试纸条可用于检测苹果汁和番茄酱中的TeA，与UHPLC-MS/MS 法的结果一致，该试纸条可用于快速检测实际样品中的TeA。

KONG Dezhao 等[51]基于TeA 单克隆抗体开发了一种横向流动免疫层析(ICA)试纸，可用于谷物和果汁中的TeA 分析，其目测检出限分别为1 600 μg/kg 和400 μg/L。小麦和苹果汁样品的检出限分别为126.4 ng/g 和65.3 μg/L，所开发的试纸对TeA 检测有效，适用于样品的现场检测和快速筛查。

钟红等[52]通过对TeA 进行衍生化，与大分子载体蛋白偶联得到人工抗原，经动物免疫获得特异性多克隆抗体，用ic-ELISA 法检测TeA，制备了具有灵敏、快速、高通量、精准、重复性高等特性的TeA 快速检测试剂盒。MAN Yan 等[53]制备了抗AME 单克隆抗体(mAb)和经4-溴丁酸甲酯与牛血清白蛋白(BSA)偶联的AME 免疫原，合成了胶体金纳米颗粒(CGN)和CGNs-mAb 结合物，开发了一种快速、便携式、半定量的免疫层析试纸条。通过竞争ELISA 法测定樱桃和柑橘中AME 的加标回收率分别为86.1%和80.7%，目测检出限约为10 μg/L。

4 结语

链格孢霉毒素在果蔬、谷物和饲料中均广泛存在，危害饲养动物和人类健康，目前已引起社会的普遍关注，因此必须从种植、生产加工和流通等环节做好预防工作并加强检测，世界各国已开始制定食品、饲料中链格孢霉毒素相关的技术标准。色谱-质谱联用技术、各种免疫分析和生物传感器方法被越来越多地用于链格孢霉毒素的检测，一些专门针对食品中链格孢霉毒素的快速检测仪器将陆续被推出。但是，目前样品处理仍旧是个短板，时间相对冗长，急需发展高选择性、高效、高通量的样品处理技术。此外，新的高灵敏度分析方法，以及高效、灵敏的样品处理-分析检测联用技术将具有广阔的发展空间和应用潜力。