光学遗传用于听力恢复的研究进展

喻思楚 王梦琪陈志峰 马贤 钟翠萍*

1中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院耳鼻咽喉头颈外科（兰州 730050）

2宁夏医科大学临床学院研究生院（银川 750004）

光学遗传是一种新型多功能工具，它让控制时空离子通道激活成为可能，利用光操纵依赖光的离子通道来控制膜电位和不同的细胞内机制[1]。这些光敏细胞膜蛋白被称为视蛋白,现已有许多不同类型的视蛋白，如I型和II型视蛋白[2]，最常用的视蛋白是通道视紫红质(channel rhodopsin，ChR)和盐视紫红质[3]。在绿藻莱茵衣藻中发现了ChR的前两种主要亚型[4]，ChR-1[5]是光敏的质子选择性通道，ChR-2[6]是光敏的非特异性阳离子通道。光激活ChR导致细胞膜去极化[7]，盐视紫红质是光门控氯离子通道，它的激活会导致细胞超极化[8]。这两个视蛋白家族在被发现后得到了进一步的证明[9]，并在这些原始家族的基础上获得了更多不同波长敏感性和动力学的视蛋白亚型[10，11]。在光照射之前，ChR必须在相应的细胞中表达，其表达是由启动子/增强子区域控制的，为了使正确的组织表达ChR，可以用病毒载体将ChR基因敲入组织中培养[3]，亦或用表达ChR的转基因动物模型进行体内和体外研究[12]。将ChR与荧光标记融合在荧光显微镜下可见[13]，可确认细胞表面的 ChR 表达[14，15]。一旦确定其表达，光照射在其表达的细胞上以驱动离子通量，通过光疗前后细胞电生理反应和离子浓度的变化来观察ChR的作用。大多数光遗传学实验都是在中枢神经系统组织中进行的，但只有一小部分在听觉系统中进行了测试[1]。这些听觉实验一直围绕着激活或灭活Corti器官中的不同细胞，以了解它们的功能，并创造一种新的耳蜗植入装置即光学人工耳蜗（optical cochlear implant，oCIs）。本文旨在从听力恢复的现状和局限性、oCIs的生物医学和光电发展现状等方面进行综述，并对oCIs的基因治疗和医疗设备的临床应用进行展望。

1 听力恢复的现状和局限性

听力损失（Hearing loss，HL）为全球范围最常见的感觉障碍性疾病，占据我国残疾人群1/4，人数约为2000多万[16]。除遗传因素外大多数HL是耳蜗性疾病，如因噪音、耳毒性药物、局部缺血、创伤或感染对耳蜗造成的伤害，且伤害一般不可逆[17]。目前感音神经性听力损失（sensorineural hearing loss，SNHL）的因果治疗还不完善，再生方法正在研究中，首个耳科的临床基因治疗旨在通过强制表达转录因子Atoh1从支持细胞再生毛细胞[18]，技术手段尚无法在活体内实现毛细胞再生[19]。现已进行了几项临床前基因替代治疗研究，阐明了典型的人类遗传性耳聋小鼠模型的原理[20]。临床转换需要在耳蜗退行性改变之前进行一定干预，并仅限于150多个已知的耳聋基因的子集中[21]。

因技术限制，目前和未来的一段时间内助听器和电子耳蜗（electric Cochlear implants，eCIs）仍将是大多数HL的听力康复的选择[17]。两者的选择取决于HL的严重程度和损伤的部位，当轻度HL时助听器分析周围的声音信号，并通过扬声器或骨耦合为耳朵提供放大和被处理过的声信号；当重度HL或耳聋患者不能通过助听器实现充分的听力康复时，可以使用eCIs，它通过直接刺激耳蜗螺旋节神经元(spiral ganglion neurons，SGNs)，从而绕过功能失调或缺失的毛细胞[22]。虽eCIs被认为是目前最成功的神经假体，但仍有其不足。eCIs的电极接触电流的广泛传播，导致SGNs的广泛兴奋，限制了人工声音编码的频率分辨率[23]，使得患者在嘈杂的背景下语言理解有困难且难以欣赏音乐。现为提高其的性能，一般使用多极刺激[24]和神经内刺激[25]来控制电流，不过效果不够理想。光在空间中可更好地被控制，听觉神经光遗传刺激可能克服eCIs的缺陷[1]。未来的oCIs有望提高人工声音编码，从而提高噪音背景下的语音识别及欣赏音乐的能力[26]。

2 oCIs的生物医学和光电发展现状

oCIs是基因治疗和光电医疗设备的结合，其发展需要生物医学和光学工程的多学科研究。近年来，基因治疗方法主要用于探索感觉恢复。美国食品和药物管理局已批准了一种基于腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因疗法，用于治疗幼年利伯氏先天性黑朦，现视网膜已经成为基因治疗前沿[27]。DiGuiseppi等[1]认为视网膜和耳蜗都只需要微小的载体剂量，而且由于血-视网膜/迷路屏障和独特的眼内/蜗内微环境对免疫反应的局部抑制作用，它们可以作为基因治疗的靶点。而Weiss等[28]认为与视网膜细胞的光遗传操作不同，由于SGNs的主体隐藏在耳蜗的骨核心罗森塔尔管中，所以对SGNs产生听神经的光遗传操作有特定的挑战。

生物医学方面oCIs可以借鉴光遗传视觉恢复，医疗器械的发展在一定程度上可以建立在eCIs听力康复的长期经验基础上。在oCIs中音频处理、经颅信号[29]和动力传输[30]等功能，可以通过圆窗将柔性和良好封装的刺激植入体前端非创伤性地插入鼓阶也可以实现类似的功能[31]。最近对经过SGNs光基因修饰的啮齿动物[10]进行的基于光纤的耳蜗光遗传学实验[32]，在实现这些目标方面取得了相当大的进展[33]。刺激由电转为光确实有一些优势，但也存在诸多挑战，亟待解决，这些将在下面讨论。

2.1 生物医学的发展

截至目前为止已经在沙鼠[34]、豚鼠[35]和猫[36]等活体动物耳蜗模型实验已证实了oCIs原理的可行性。Hernandez[37]、Keppeler[38]、Duarte[39]各自带领的研究团队已在体外测量到通过光纤激活SGNs，表明光遗传学工具具有适当的听觉系统刺激的速度和功率。一些研究方法已经允许在体外以高时空分辨率控制基因表达[40]，并正在针对不同的哺乳动物细胞系[41]和体内[42]研究进行优化。光遗传基因表达控制已在细菌、酵母以及不同的哺乳动物细胞系[43]中检测出阳性结果。原理研究的第一个证据报道了在Thy1.2启动子下[44]，转基因鼠神经表达ChR2的听觉系统的光遗传激活[29]。通过ChR2-EYFP免疫荧光在SGNs以及光学诱发电位(optical auditory brainstem responses，oABRs)，是单一听觉神经纤维放电和听觉中脑局部场电位中显示功能性表达。其与听神经的声学和电刺激相比，表明在低光水平下提高光谱选择性的可行性，但相比于SNGs的生理发射率，光遗传编码的时间保真度相对较差。将人突触蛋白启动子下携带钙转运ChR2变体(calcium-translocating ChR2-varian，CatCh)的AAV注射到胚胎耳囊[45]，鼠听觉神经的光遗传激活也被证实[29]。

后续研究，通过向出生后早期小鼠内耳注射卵泡内病毒建造动物模型，证实听觉通路的光遗传激活，使用快速通道ChRs，并提供时间信息的光遗传编码的更详细的特征，以提高保真度。在人类突触蛋白启动子下注射带有红光转移、快速门控的ChRvariant f-Chrimson的AAV，可使oABRs的低阈值0.5μJ达到200 Hz，听神经纤维反应达到几百Hz[31]。Klapoetke等[46]研究中，在人类突触蛋白启动子下注射有效的AAV-PHP，携带快速的ChR Chronos，包含内整流钾通道的高尔基转运序列，使SGNs反应在群体和单个神经元水平上达到几百Hz。因此，f-Chrismson和Chronos都支持接近生理速率的SGNs放电。这两项研究都在注射耳的所有频率区域实现了高转导率[10]，且没有造成明显的SGNs损失[31]。在这些研究中，强刺激诱发的oABRs的潜伏期、波形和波幅与生理的听性脑干反应相似，反映了注射耳听觉神经的特异性的光遗传激活。但在未注射的对侧耳中，ChR表达可明显传播病毒。另一项在不同实验室进行的研究涉及在CAG启动子的控制下，将携带原始Chronos的AAV-Anc80注射到出生后的小鼠耳中，并显示了可能涉及毛细胞激活的oABRs，因为即使AAV局部应用于内耳[32]，CAG也能促进SNGs以外的表达。

沙鼠的听觉频率与人类相近，可用其实现病毒介导的光基因SGNs操作[30]。将携带CatCh的AAV直接注射到突触蛋白启动子下的耳蜗轴中，可在所有压力位区域的SGNs中产生CatCh表达，在大约一半的注射动物中，平均表达率为30%，仅10%表达CatCh的SGNs即可诱导oABRs。oABRs波幅小于小鼠，但潜伏期较短，刺激可达约200 Hz。在注射的耳朵中发现了轻微的SGNs损失(20-30%)，在对照组动物注射盐水时也观察到，这可能是内部蜗轴压力增加引起的。用沙鼠来演示光遗传SGNs刺激的感知:基于光纤的单通道oCIs使沙鼠在激光阈值低于2μJ的情况下学习刺激的回避行为[30]。动物的回避行为从光刺激转移到声刺激，表明刺激从光到声的感知存在一定的泛化[17]。

成年沙鼠表达CatCh被用于全面研究自然和人工SGNs刺激的光谱选择性[33]，采用声、光、电等刺激对侧耳蜗时，在听觉中脑进行神经元簇活动的多通道记录。在耳蜗张力轴不同位置放置多达3根激光耦合光纤进行光刺激，在听觉中脑的张力对应区域观察到空间选择性神经元活动[33]。在所有激活强度下，光遗传刺激比单极电刺激更具选择性，在中、高激活强度下均优于双极电刺激。光刺激在较低和适中的激活水平下与声波刺激一样具有选择性，但在较高的刺激强度下可引起更广泛的激活[33]。通过Monte Carlo射线追踪模拟光在耳蜗中的传播，证实了生理评估所证明的光谱选择性的提高[30，33]。进一步表明，较小孔径和较窄光束轮廓的发射体以及距离目标神经组织较近的发射体可以进一步提高光刺激的光谱选择性。

目前研究通过为SGNs刺激提供生理或行为证据，证明了光遗传听力恢复的可行性。在ChR-2转基因小鼠中，药理学或基因干扰听觉[29]后仍可诱发oABRs，在氨基糖苷致聋后，光刺激SGNs在生理和行为水平上重新激活沙鼠的听觉系统[30]。小鼠视蛋白表达的稳定性和生物安全性在注射后的9个月已经被发现，f-Chrimson稳定表达且没有SGNs的损失[31]。另一项研究发现，病毒注射后6-18周，小鼠听神经中有类似的Chronos表达水平[47]。在植入光纤的沙鼠中，重复的oABRs测量显示植入后100多天内，对光刺激SGNs有稳定的反应[30]。未来的实验需要整合这些方法，并在行为水平上证明耳蜗光遗传学的光谱特异性，理想的方式是结合生物安全的纵向研究。

2.2 多通道oCIs的发展方向

总结多项实验研究结果，有理由相信以光作为能量来源的oCIs或许将成为一种可精确刺激耳蜗特定区域且有潜力的助听装置[48]。除了生物医学方面的困难需要攻克外，我们还需要去着力研究oCIs的光学传导的工具，目前的研究集中于研究多通道oCIs。多通道oCIs工程正在迅速发展，采用了两种基本策略:有源oCIs(将光电发射器带入耳蜗)和无源oCIs(使用波导将脑外发射器的光引入耳蜗)[49]。oCIs必须具备生物相容性、安全性和长期稳定性，设计要求包括集成了几十到数百个刺激通道，可接受的能量预算和热释放的节能光学发射器，狭窄的光束轮廓和适当的定位在鼓阶发射器，合适的形状因素和低刚度。

2.2.1 有源oCIs

有源oCIs的发光元件更靠近SGNs，避免在波导内外耦合时的光损耗，目前发光元件考虑发光二极管（light emitting diodes，μLEDs）和激光二极管。商用μLEDs是在20mm长，0.24mm宽的柔性聚酰亚胺基板上进行组装[39]，10个可以单独处理的μLEDs间距为350或500mm，在5mA的电流驱动下，μLEDs的光功率约为0.3mW[50]。另一项研究使用15个μLEDs，嵌入生物兼容的硅酮，并将该oCIs植入鼓阶中，其插入力可与商业可用的eCIs相媲美[51]。定制微尺度μLEDs薄膜，已开发尺寸小至50*50μm[52，53]，并已描述了平行晶圆级制造[43]。这种总宽度为230μm，长度为5mm的oCI封装了4个50*50*15μm，可以通过圆窗插入鼠耳蜗。基于已建立的晶圆级工艺，最近设计的oCIs的宽度为350μm，长度为15mm，共144个分别可寻的μLEDs50*50μm。在下一代基于μLEDs的光学元件中，全环氧基载体最大限度地减少了热机械弯曲。此外，光功率大幅提高:在10mA时，输出功率达到0.82mW。最后，最高温度增加1℃当种植体放置在琼脂糖上时，用持续时间为20ms、强度为10mA的直流脉冲驱动μLEDs，测量C值，使该种植体适合于体内应用[44]。在后续的研究中，通过添加锥形聚光器和由聚二甲基硅氧烷制成的球形微透镜，这些基于μLED的光学器件的光学性能得到了改善[54]。对于主动oCIs的转换，需要长时间稳定、透明的封装，以保持oCIs的足够灵活性。目前面临的挑战是，要在不破坏光电元件的情况下，实现对水蒸气和离子的足够屏障功能，以保护光电元件，同时避免光电元件粒子扩散到耳蜗。

2.2.2 无源oCIs

无源oCIs利用波导将外部光源传送到耳蜗，所以它可将光电子从耳蜗中分离出来，并像最先进的eCIs和心脏起搏器一样将其密封起来。其优点是稳定性、生物相容性、较低的耳蜗热产生和较小的尺寸的蜗内光发射器，缺点是在发射光波导界面和沿波导内耦合时的光损耗，影响了这种耦合的潜在机械磁化率[55]。最近报道了一种由8根直径为25μm的玻璃纤维包埋在硅树脂中的无源oCIs，该装置测量的插入力与传统的eCIs相当，在人类颞骨中插入深度可达20mm[56]。采用芯厚低于10μm的聚合物基波导，提供了一种替代方法，特别是考虑到灵活性和独立刺激通道的数量[42，46，57]，但聚合物纤维的光传播受到波长依赖性的限制。

3 展望

oCIs的相关研究已取得巨大的突破，但绝大部分仍停留在动物试验阶段。未来的研究重点在于基因治疗、医疗设备等方面临床化。在基因治疗中耳蜗光学遗传学的有效性、稳定性和生物安全性为临床应用提供可能，听觉神经光敏的结构应设计为在生理发射速率和低光需求下使SGNs强光遗传激活，神经转导所需的载体应该得到优化，以便安全有效地传递其基因负载。最近，两项涉及AAVs介导的光遗传视觉恢复的临床试验已获批准，证实了光遗传治疗神经恢复的潜力[17]。

与典型的基因治疗不同，SGNs的光遗传学操作并不是为了自身恢复听力，它需要结合oCIs这种医疗设备，由外部声音处理器、内部发光植入物以及这些设备之间的适当编码程序组成。虽然通信和处理器技术可以借鉴eCIs，但由于视蛋白动力学突破时域限制和刺激通道的增加很可能需要对编码程序进行大量的重新工作。足够SGNs激活的最小光脉冲持续时间和强度将取决于所选光遗传工具的通道动力学。单个脉冲的能量需要在其持续时间和强度之间进行平衡，且需考虑到oCIs的合理电池寿命。另外，光学刺激的结果模式将被映射到一套与eCIs增加的独立刺激通道，以编码光谱信息。虽然光发射器的最终数量仍有待确定，但据估计，光发生SGNs刺激的光谱选择性至少比电编码高出两倍，50-100光学发射器为目标的范围似乎是一个合理的数目[21]。

综上所述，在oCIs大规模应用临床前，我们需要最大限度地保证患者的安全的前提下，去优化相关基因治疗方式，改进相关医疗设备。基于目前的科研技术和研究基础，我们相信光学遗传用于听力恢复将会是一个很有前途的领域,oCIs也将会大幅度提高SNHL患者的生活质量。