丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌的抑菌活性及机制

崔 醒，朱秋劲，侯 瑞，万 婧,3,*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学林学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025）

镰刀菌属真菌可以侵染多种农作物和经济作物，引起小麦、大麦和燕麦的赤霉病和茎基腐病以及玉米的穗腐病等[1]。镰刀菌侵染农作物后分泌的单端孢霉烯族毒素是目前粮食及食品加工产品中主要的真菌毒素来源。这些真菌疾病一直威胁着全球粮食的产量和质量（受感染的谷物含有毒性很强的呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）），也是制约我国及世界粮食安全和食品安全的重要因素。被感染的谷物在收获、贮藏运输或加工过程若遭遇高温高湿条件则可能出现真菌的二次生长，所产生的毒素由于稳定性较高会经由加工链进入食品或饲料，严重危害人畜健康，如玉米赤霉烯酮可使猪发生雌性激素亢进症，单端孢霉素类则阻碍蛋白质合成而引起动物呕吐、腹泻和拒食[2]。世界范围内的真菌污染导致约20%的田间减产和约10%的采后损伤。据美国疾病控制中心估算，全球约有超过450万 人长期暴露于高真菌毒素含量的食物[3]。由于真菌及其毒素的污染无法完全从田间去除，因此，开发积极有效的采后真菌和真菌毒素控制措施是农产品和食品工业中亟待解决的重要问题。目前，我国用于控制农产品采后真菌及真菌毒素污染的方法主要是人工合成的杀菌剂，如吡咯苯类、咪唑类和硫氰酸类等，但因受到其化学残留安全性、环境降解周期长，尤其是过度使用造成的真菌耐药性问题凸显而逐渐被禁用，迫使农业及食品工业积极探索毒副作用小、环境友好且具有新型作用机制的抗菌剂或杀菌剂。植物精油因其高效的广谱抗菌性、良好的生物降解性和食品安全性而成为化学合成杀菌剂最热门的候选之一[4]。植物精油是芳香植物为进行自我防御而产生的次级代谢物，通过在花、芽、叶和树皮等部位提取而得到的挥发性物质的复杂混合物。由于精油的化学组分复杂且异变（易受生长环境和提取条件的影响），极大地削弱了精油的生物活性且使阐明其抑菌机制变得困难。团队前期筛选出富含苯酚类化合物如丁香酚、百里香酚和香芹酚的植物精油（丁香精油和百里香精油）能高效抑制禾谷镰刀菌的生长和产毒[5-6]。因此，可以从精油中分离出丁香酚、百里香酚和香芹酚单独研究其对禾谷镰刀菌的抑菌作用和机制。

植物精油及其活性成分抑制微生物的机制主要包括：1）损伤真菌细胞壁和细胞膜[7]；2）使菌丝体DNA、RNA、脂类和蛋白质等生物合成受到抑制，相关基因不能表达，进而使其失去对代谢的调节控制以及自我复制的正常进行，最终导致细胞死亡[8]；3）损伤真菌的细胞能量代谢途径[9]；4）对真菌产毒基因的抑制作用[10]。尽管植物精油及其活性成分的抗菌机制在细胞水平被广泛报道，但在对禾谷镰刀菌的抑制机制在基因水平的阐明还很匮乏。禾谷镰刀菌全基因组序列的公布以及单端孢霉烯族毒素合成基因、基因簇和生物合成途径的不断挖掘为基因水平研究植物精油及其活性成分对禾谷镰刀菌的作用机制提供了便利。目前已经明确单端孢霉烯族毒素的生物合成至少涉及到3个基因家族，分别为Tri5基因簇、Tri1-Tri16基因簇和Tri101基因簇[11]。利用转录组学技术可研究苯酚类化合物对禾谷镰刀菌细胞在转录水平，包括编码和非编码蛋白RNA的影响及其差异[12-13]。综上所述，在前期工作的基础上，以具有高效抗菌活性的3种苯酚类植物精油活性成分丁香酚、香芹酚和百里香酚为研究对象，明确其对禾谷镰刀菌菌丝生长、孢子萌发和DON合成的抑制效应，从细胞水平研究其对禾谷镰刀菌细胞膜、细胞内容物和能量代谢等生理影响，最后通过RNA-Seq测序从转录组水平探明3 类苯酚类化合物抑制禾谷镰刀菌的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）由贵州大学林学院提供。

丁香酚、香芹酚和百里香酚（食品级≥98%） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）及其他试剂 贵州慕为美科技有限公司；KA08304H DON残留酶联免疫吸附测试试剂盒 北京勤邦生物技术有限公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）、ATP含量检测试剂盒南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 仪器与设备

Spectra Max 190光吸收型酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；GTR16-2医用离心机 北京新时代北利医疗器械有限公司；Mini系列桌面型离心机 生工生物工程（上海）股份有限公司；SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；ROB15 HEAL FOECE超纯水系统 上海康雷分析仪器有限公司；DMEX20系列生物显微镜 宁波舜宇仪器有限公司；DDSJ-308A电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种制备

菌种活化：从-80 ℃斜面保存的禾谷镰刀菌菌种中，挑取一小块菌丝，接种于PDA平板，25 ℃黑暗环境中培养3 d，菌落边缘切取菌丝块，接种于PDA平板，同样条件下活化3 d。

孢子储备液制备：取7 mm新鲜菌饼，接种到绿豆琼脂培养基平板，25 ℃、12 h紫外/12 h黑暗环境下培养4～8 d后，每个平板用5 mL灭菌超纯水洗脱，经过2 层拭镜纸过滤后，血球计数板计数。将洗脱下的孢子液以体积比1∶100添加到灭菌后的羧甲基纤维素培养基中，25 ℃、175 r/min见光培养3 d，抽滤。得到的孢子液在4 ℃、8 600 r/min下离心10 min，下层沉淀为孢子储备液。

菌丝富集：用10 mL灭菌超纯水将菌丝从PDA平板洗脱，所得的菌丝溶液以体积比1∶100添加到灭菌后的酵母浸出粉胨葡萄糖培养液中，25 ℃、175 r/min见光培养3 d。抽滤除去废液，所得菌丝体用无菌纯水洗涤3 次。

1.3.2 丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌的抑制能力测定

丁香酚、香芹酚和百里香酚溶于无水乙醇得到0.006、0.012、0.018、0.024、0.036 mol/L的丁香酚溶液、0.007、0.013、0.019、0.026、0.039 mol/L的香芹酚溶液和百里香酚溶液。采用平板涂布法将400 μL不同活性成分溶液涂抹在PDA平板表面，接种新鲜菌饼（直径5 mm），25 ℃避光环境下培养3 d，测量菌丝直径。以不含植物精油活性成分的无水乙醇为对照组。参照Wan Jing等[14-15]的方法计算百里香酚、丁香酚和香芹酚抑制菌丝生长的半数有效作用浓度（50% effective concentration，EC50）。

1.3.3 丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌的孢子萌发抑制能力测定

将丁香酚、香芹酚和百里香酚溶于无水乙醇得到0.030、0.059、0.089、0.119、0.149、0.239 mol/L的丁香酚溶液、0.032、0.065、0.097、0.130、0.162、0.261 mol/L的香芹酚溶液和百里香酚溶液。500 μL溶液与孢子液（1×105个/mL）等体积混合后，取40 μL混合液涂抹在琼脂平板表面，25 ℃黑暗环境下培养10 h后，生物显微镜下计数。对照组使用500 μL孢子液与无水乙醇等体积混合。参照Wan Jing等[15]的方法计算丁香酚、香芹酚和百里香酚抑制孢子萌发的EC50。

1.3.4 丁香酚、香芹酚和百里香酚对DON毒素生物合成抑制测定

禾谷镰刀菌的孢子液（1×107个/mL）按体积比1∶1与浓度为EC50和10×EC50的不同活性成分溶液混合。接种到已灭菌的大米培养基上，25 ℃避光条件下培养30 d，每天定时摇匀培养基[14-15]。对照组使用孢子液与无水乙醇等体积混合。大米培养基经真空冷冻干燥后粉碎，按照DON残留酶联免疫吸附测试试剂盒说明书检测培养基中DON含量。

1.3.5 丁香酚、香芹酚和百里香酚对菌丝电导率的影响

参考Duan Yabing等[16]的方法并作适当修改，将1 g菌丝体重悬于10 mL不同浓度（EC50、10×EC50、100×EC50）的活性成分溶液中，用电导率仪测定0 h菌丝溶液的电导率，2.5 h后将菌丝体煮沸5 min，测定最终电导率。2.5 h电导率差值计算公式如下。

1.3.6 丁香酚、香芹酚和百里香酚对菌丝体中MDA和ATP含量的影响

称取1 g菌丝体重悬于10 mL不同浓度（EC50、10×EC50、100×EC50）的活性成分溶液中，混匀5 s，25 ℃黑暗环境培养12 h，无菌超纯水洗涤3 次，加入体积分数0.9%无菌生理盐水进行超声破碎，5 000 r/min离心5 min取上清液。对照组使用孢子液与无水乙醇等体积混合。按照微量MDA检测试剂盒说明书，每个样品取100 μL检测其MDA含量；按照ATP含量检测试剂盒说明书，每个样品取30 μL检测其ATP含量。

1.3.7 转录组测序分析

菌丝处理方式参考1.3.6节。洗涤后的菌丝用3 mL离心管冻存，委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA提取和RNA-Seq测序。原始数据经过过滤获得Clean Reads。采用每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）（即每百万Reads的每kb外显子片段）方法计算和归一化EC50丁香酚乙醇溶液处理的Eug01组、EC50香芹酚乙醇溶液处理的Car01组、EC50百里香酚乙醇溶液处理的Thy01组以及生理盐水处理的NS组的基因表达水平。以错误发现率（false discovery rate，FDR）小于0.01和差异倍数（fold change，FC）大于4作为标准筛选差异基因。使用ClusterProfile软件进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 数据统计与分析

每组实验均重复3 次，实验结果均表示为平均值±标准差。用Excel软件建立数据库并作图，采用SPSS 2.0软件对结果进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 3种活性成分溶液对菌丝生长及孢子萌发的影响

丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌菌丝生长和孢子萌发有抑制作用且呈剂量依赖性。随着活性成分浓度的升高，菌落直径明显缩小，生长趋势减弱，孢子存活概率小，丧失繁殖能力。用抑制50%菌丝生长或孢子萌发的EC50衡量3种苯酚类活性成分对禾谷镰刀菌菌丝生长的抗菌活性，由表1可知，百里香酚和香芹酚对禾谷镰刀菌的菌丝生长的抑制效果优于丁香酚；百里香酚对禾谷镰刀菌孢子萌发的抑制效果最好，丁香酚和香芹酚次之。

表1 丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌菌丝生长和孢子萌发抑制作用的EC50Table 1 EC50 of eugenol, carvacrol, and thymol against the mycelium growth and spore germination of F. graminearum

2.2 3种活性成分溶液对DON合成的影响

DON是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌及其他产毒的镰刀菌木霉菌等产生的有毒次级代谢产物，作为一种常见的单端孢霉烯族毒素，DON在谷物食品中检出率和超标率较高。DON含量的减少能够降低谷类及其相关制品的安全风险。由图1可知，与对照组相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚均能显著降低DON的合成（P＜0.05）。10×EC50百里香酚溶液相对于EC50百里香酚溶液处理后，20 g大米培养基中DON含量由96.848 μg/L降低到81.465 μg/L。相对于EC50，10×EC50丁香酚和香芹酚处理后，DON含量分别降低了21.304 μg/L和4.384 μg/L。在EC50水平下百里香酚抑制DON生成的效果显著优于丁香酚和香芹酚，在10×EC50处理浓度下百里香酚和丁香酚的抑制效果显著优于香芹酚，说明百里香酚和丁香酚抑制DON生成的效果较好。经转录组结果分析发现，百里香酚能同时引起DON生物合成相关基因TRI5和TRI6的下调，而丁香酚和香芹酚只分别作用于TRI6和TRI5。综上所述，百里香酚对禾谷镰刀菌产生DON的抑制效果优于香芹酚和丁香酚处理。

图1 丁香酚、香芹酚和百里香酚对DON合成的影响Fig. 1 Effects of eugenol, carvacrol, and thymol against the biosynthesis of deoxynivalenol by F. graminearum

2.3 3种活性成分溶液对电解质泄漏的影响

细胞膜是微生物屏障，既可以阻挡外源物质进入，也可以防止内部物质流出。若细胞膜遭受损坏，流动性被抑制，膜渗透性改变，胞内电解质发生外漏，最终会影响菌体生长[17]。采用电导率法验证了在丁香酚、香芹酚和百里香酚作用下禾谷镰刀菌菌丝体膜通透性的变化（表2）。与对照组相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚均引起禾谷镰刀菌电导率值增加，且随着处理液浓度的增大，菌丝体溶液的电导率值呈上升趋势，说明丁香酚、香芹酚和百里香酚引发细胞膜损伤。100×EC50作用下，香芹酚对细胞膜的损伤程度明显超过丁香酚和百里香酚。百里香酚及其纳米乳处理禾谷镰刀菌后，扫描电子显微镜下均能观察到菌丝体出现不规则收缩，细胞内膜的完整性和通透性被破坏[8,18]。

2.4 3种活性成分溶液对菌丝体中MDA和ATP含量的影响

植物精油可能引起禾谷镰刀菌细胞发生脂质过氧化，脂质过氧化改变膜结构和功能的完整性，产生MDA副产物。由表2可知，各处理组MDA浓度与对照组相比均增加，随着处理液浓度的升高，菌丝体溶液的MDA浓度增加，说明禾谷镰刀菌受到刺激后，细胞发生脂质过氧化程度增加。与之结果相似，Kalagatur等[19]发现鲁沙香茅精油处理后的小麦赤霉病菌细胞中MDA含量增加。MDA可进一步与DNA发生反应，与2’-脱氧鸟苷产生丙烷加合物，对细胞信号传导、增殖、分化和凋亡等生理功能产生不利影响。

表2 丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌菌丝体电导率、ATP、MDA浓度的影响Table 2 Effects of eugenol, carvacrol, and thymol on the conductivity, ATP content, and MDA level of mycelium solution

ATP作为能量转换载体，其水平的改变会影响细胞功能。由表2可知，各处理组禾谷镰刀菌菌丝溶液中ATP浓度均低于对照组，且随着处理浓度的增加，ATP含量不断下降；与EC50相比，10×EC50香芹酚处理禾谷镰刀菌后，菌丝溶液中ATP含量由0.090 mmol/L降为0.046 mmol/L，但无显著差异（P＞0.05）；表明经过处理的禾谷镰刀菌细胞内线粒体产能不足。通常，ATP含量降低预示线粒体功能受损，细胞处于凋亡、坏死或毒性状态下。丁香酚还能够引发娄地青霉和黑曲霉线粒体形态损伤和功能受损[20]。

2.5 基因差异表达分析

从图2看出，丁香酚对禾谷镰刀菌的影响最大，显著差异基因数最多（225个），上调差异基因19个，下调差异基因206个。与对照组相比，香芹酚处理禾谷镰刀菌后得到139个差异基因，其中30个基因表达上调，109个基因表达下调。百里香酚溶液处理后，得到135个差异基因，上调基因（10个）占7.41%。此外，禾谷镰刀菌经处理后表达下调的基因数高于上调基因，这些基因的表达可能受到丁香酚、香芹酚和百里香酚明显的干预。高弢等[21]利用麝香草酚处理禾谷镰孢菌后进行转录组分析也发现了类似趋势。这说明菌株可以通过调整部分基因的表达应对不同苯酚类植物精油活性成分的刺激。

图2 禾谷镰刀菌响应丁香酚、香芹酚和百里香酚刺激下的转录组学分析Fig. 2 Transcriptomic analysis of F. graminearum treated with eugenol,carvonol or thymol

2.6 差异表达基因的GO功能富集分析结果

差异表达基因的GO功能富集分析结果表明（图3），与对照组相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚处理后所得差异基因在生物学过程的核糖体生物发生、核糖核蛋白复合物生物发生、rRNA加工、rRNA代谢过程、ncRNA加工、细胞成分生物发生；细胞组分的氧化还原酶复合物、质子转运ATP合酶复合物、耦合因子F(o)的质子转运ATP合酶复合物、质子转运结构域的质子转运双区ATP酶复合物和分子功能的血红素结合、四吡咯结合、分子内氧化还原酶活性等12 条GO term均存在富集。

图3 禾谷镰刀菌响应丁香酚、香芹酚和百里香酚刺激下的GO功能富集前30个通路Fig. 3 Top 30 GO enriched pathways of F. graminearum treated with eugenol, carvonol or thymol

丁香酚、香芹酚和百里香酚破坏核糖体和线粒体结构，影响禾谷镰刀菌的能量和物质代谢。这也验证了禾谷镰刀菌细胞内ATP含量降低是由于丁香酚、香芹酚和百里香酚破坏了禾谷镰刀菌线粒体的结构，造成能量供应不足。此外，GO富集结果显示丁香酚借助甲基转移酶调控基因表达和生理过程中间产物的合成与降解反应。香芹酚改变了禾谷镰刀菌膜蛋白的结构和功能，这可能是由于脂质过氧化的存在。禾谷镰刀菌通过调整微管蛋白和肌动蛋白细胞骨架响应里香酚的刺激。

2.7 差异表达基因的KEGG数据库注释分析结果

通过KEGG数据库系统分析差异表达基因在禾谷镰刀菌中的代谢途径和功能。结果表明，丁香酚、香芹酚和百里香酚处理的禾谷镰刀菌差异基因被共同注释到18 条通路（表3）。此外，丁香酚处理（Eug01组）的禾谷镰刀菌差异基因还被注释到氮代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、乙醚脂质代谢、抗坏血酸和醛糖代谢、肌醇磷酸代谢、苯丙氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸互变、酪氨酸代谢等。香芹酚处理（Car01组）的禾谷镰刀菌差异基因还注释到氮代谢、基础转录因子、精氨酸和脯氨酸代谢、柠檬酸循环（三羧酸循环）、核苷酸切除修复、乙醛酸盐和二羧酸盐和碳代谢。百里香酚处理（Thy01组）的禾谷镰刀菌差异基因还被注释到RNA降解和酪氨酸代谢。

表3 DON生物合成中心基因的转录水平Table 3 Transcriptional levels of the central genes of DON biosynthesis

RNA翻译到蛋白质发生在核糖体。真核生物的80S核糖体定位于其胞质，由核糖体RNA及核糖体蛋白质组成。核糖体的大小亚基相互配合共同在蛋白质合成过程中将mRNA转化为多肽链。香芹酚处理后，下调基因富集到真核生物中的核糖体生物发生，大多数核糖体基因与翻译功能、核糖体结构和生物发生有关，这表明核糖体结构发生改变，转录过程受到影响，蛋白质合成受到抑制。

氧化磷酸化由电子传递链和磷酸化两部分构成，电子通过电子传递链产生跨膜的质子梯度即质子动势，用于驱动ATP合酶合成ATP，为DNA复制、转录和蛋白合成等生理过程提供能量[22]。禾谷镰刀菌经丁香酚、香芹酚和百里香酚处理后，差异基因在氧化磷酸化途径存在显著富集，说明参与氧化磷酸化的线粒体复合物I、复合物II、复合物III、复合物IV和复合物V受到严重影响，能量合成被抑制，ATP含量降低。线粒体功能障碍导致细胞中的活性氧迅速增加，氧化还原酶和过氧化氢酶活力被降低，活性氧水平超过防御机制，细胞处于氧化应激状态，导致脂质过氧化，MDA含量增加，细胞膜的流动性和通透性发生改变，菌丝体溶液电导率增加。柠檬醛通过积累大量活性氧破坏氧化磷酸化途径和细胞膜的完整性，抑制洋青霉菌生长[23]。氧化应激还会引起蛋白质氧化、核酸损伤、酶抑制，甚至造成细胞程序性死亡。

微生物受到不良刺激后，激活自我保护系统，改变细胞膜脂肪酸组分来保持其流动性。脂肪酸合成与代谢通路相关的差异基因表达下调，说明丁香酚、香芹酚和百里香酚可能抑制了禾谷镰刀菌自我保护能力。百里香酚具有扰乱细胞膜脂质双分子层的能力，可导致细胞膜通透性的增加。

核苷酸切除修复是最普遍的DNA修复机制，识别和处理活细胞中多种类型的DNA损伤[12]。禾谷镰刀菌菌丝调控DNA修复机制应对丁香酚引起的DNA损伤。单萜橙花醇引起了甘薯黑斑病菌核染色质的浓缩和伴随的DNA裂解，导致DNA修复基因表达上调，丁香酚也破坏和降解娄地青霉和黑曲霉的DNA[24-25]。

ABC转运蛋白在禾谷镰刀菌的抗药性和发病机制中发挥着重要而多样的作用[26-27]。丁香酚、香芹酚和百里香酚处理后，差异基因富集到ABC转运蛋白，说明物质的主动运输过程发生改变，重金属解毒、脂质代谢、信号传导、多药抗性、核糖体生物合成和mRNA转运等多种生命活动均受到影响[28]。

从上述结果来看，丁香酚、香芹酚和百里香酚有可能通过影响禾谷镰刀菌核糖体结构和功能，造成氧化磷酸化途径相关酶活的改变，导致线粒体功能障碍，ATP合成减少，氧化应激状态被激活，引发脂质过氧化，细胞膜损伤。同时，禾谷镰刀菌自我保护能力被抑制，加剧了细胞损伤程度，耐药性下降。

2.8 参与DON生物合成途径的基因表达分析结果

DON的生物合成包含一系列的酶促反应，约有12～16个相关基因参与调控。丁香酚、香芹酚和百里香酚作用后，禾谷镰孢菌中参与DON生物合成的TRI基因转录水平变化如表4所示。在本研究中，与NS组相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚处理后，编码C7、C8或C7,8加氧酶的TRI1基因、编码转录蛋白的TRI10基因、编码C15羟化酶的TRI11基因、编码C3乙酰化酶的TRI101基因出现不同程度的下调表达，编码单端孢霉烯3-O-酯酶的TRI8基因和编码毒素外排泵的TRI12基因上调表达。百里香酚引起DON生物合成通路关键基因TRI5和TRI6基因下调表达，TRI5基因是DON生物合成第一步的关键基因[29]，其编码的单端孢霉二烯酶催化法尼基焦磷酸骨架结构环化形成母核结构单端孢二烯[30]。TRI6是单端孢霉烯合成的正调控因子，禾谷镰刀菌中TRI6基因缺失后DON和T-2毒素合成能力完全丧失，且多个参与DON毒素合成的TRI表达量也明显下调[31-33]。体外产毒实验结果证实百里香酚对禾谷镰刀菌产生DON的抑制效果最优。

表4 DON生物合成中心基因的转录水平Table 4 Transcriptional levels of the central genes of DON biosynthesis

2.9 MAPK信号通路相关的基因表达分析结果

DON的生物合成除受TRI基因调控以外，还受到MAPK信号通路的调控。禾谷镰刀菌MAPK通路包含3个磷酸化途径：参与调控细胞壁完整性的Mgv1、参与信息素信号途径的Gpmk1、参与高渗透性甘油信号途径的FgHog1[34-35]。丁香酚、香芹酚和百里香酚均上调了Gpmk1磷酸化途径的FgSte11、FgSte7基因，下调了Mgv1磷酸化途径的FgMgv1基因和FgHog1磷酸化途径的FgPBS2、FgSSK2中心激酶基因（表5）。FgMgv1中心激酶基因缺失后，DON毒素的生物合成能力基本丧失，细胞壁严重缺损，菌落生长缓慢[36]。破坏禾谷镰刀菌Gpmk1磷酸化途径导致菌丝生长缓慢，分生孢子产率和DON产量下降[37]。FgHog1磷酸化途径的FgPBS2、FgSSK2中心激酶基因同样参与了菌丝生长、有性生殖、毒素合成和植物侵染等过程[38]。

表5 MAPK信号通路中心激酶基因的转录水平Table 5 Transcription levels of central kinase genes in MAPK signaling pathway

3 结 论

通过体外抑菌实验表明丁香酚、香芹酚和百里香酚对禾谷镰刀菌菌丝生长抑制的EC50为0.015、0.006 mol/L和0.005 mol/L，对孢子萌发抑制的EC50为0.116、0.130 mol/L和0.076 mol/L。丁香酚、香芹酚和百里香酚作用于禾谷镰刀菌核糖体和线粒体，抑制酶的生成，氧化磷酸化途径失调，引起脂质过氧化，导致细胞膜损伤，电解质渗漏，能量代谢失衡。百里香酚下调了DON生物合成途径中关键基因TRI5和TRI6的表达，达到最优抑制效果。丁香酚、香芹酚和百里香酚通过Mgv1磷酸化信号通路调节DON毒素合成。本研究从分子水平阐释了丁香酚、香芹酚和百里香酚3种精油活性成分对禾谷镰刀菌的抑制机制，对精油活性成分用于食品工业采后真菌和真菌毒素控制具有参考价值。RNA-Seq测序发现，经过处理的禾谷镰刀菌有关自身修复的基因下调，自我保护能力被抑制，可能会加剧细胞损伤程度，造成耐药性下降，后续工作可围绕这一点展开研究。