牛乳低聚糖的结构和功能研究及其开发应用

董人华，滕国新，王晓杰，王秀丽

（1.北京中医药大学，北京 102488；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，北京 101117；3.北京电子科技职业学院，北京 101100）

0 引言

牛乳低聚糖(Bovine milk oligosaccharides，BMO)和母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMO），分别为牛乳和母乳固形物中第三大成分，具有促进肠道内有益菌生长繁殖、调节肠道微生态，阻断致病菌对肠黏膜侵袭、调节免疫系统，促进新生儿大脑发育，发挥抗病毒以及预防和治疗坏死性肠炎（NFC）、婴幼儿腹泻、早产儿肠道感染等作用[1-2]。

人初乳和成熟乳分别含有22～24 g/L和12～13 g/L的低聚糖，相比之下，产后立即收集的牛初乳中仅含有约1～2 g/L的寡糖，且该浓度在48 h后迅速降低[3]。哺乳的第一周，BMO丰度下降较快，随着初乳向成熟乳的过渡，BMO丰度进一步下降，成熟牛乳中约含100 mg/L的BMO[4]。尽管BMO的浓度和丰度较HMO低，BMO仍是HMO模拟物的潜在来源，对BMO的研究具有十分重要的意义。

1 BMO的一般结构

牛乳低聚糖(BMO)和母乳低聚糖（HMO）一般由3～14个单糖通过糖苷键连接，通常为直链或支链结构，在乳腺中组装而成[5]。组成BMO的单糖有D-葡萄糖（Glucose，Glc）、D-半乳糖（Galactose，Gal）、L-岩藻糖（Fucose,Fuc）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）和N-乙酰神经氨酸（Nacetylneuraminic acid，Neu5Ac）、N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）6种[6]。由于CMPN-乙酰神经氨酸羟化酶在人乳中的缺失，HMO不含N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）单糖基[7]，HMO只有5种单糖基组成[1]。牛乳低聚糖和母乳低聚糖的单糖基组成，如表1所示

表1 BMO和HMO的单糖基构成

目前发现的HMO超过200种结构[2]，而BMO超过60种结构[4]。两者在其还原端都含有乳糖核心（Gal（β1-4）Glc），而BMO在其还原端还具有N-乙酰乳糖胺（Gal（β1-4）GlcNAc）单元。BMO和HMO可在乳糖核心结构的基础上以α-1,2、α-1,3和α-2,3、α-2,6糖苷键分别连接岩藻糖基和N-乙酰神经氨酸，组成2’-岩藻糖乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、3’-岩藻糖乳糖（3’-fucosyllactose，3’-FL）和3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）、6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）。BMO又可在N-乙酰乳糖胺核心结构的基础上以α-2,3、α-2,6糖苷键分别连接N-乙酰神经氨酸，组成3’-唾液酸乳糖胺（3’-sialyllactosamine，3’-SLN）和6’-唾液酸乳糖胺（6’-sialyllactosamine，6’-SLN）。BMO和HMO还可在乳糖核心的基础上连接半乳糖-β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal(β1-3)GlcNAc，1型链结构），形成乳糖-N-四糖（LNT）；或连接半乳糖-β1,4-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal（β1-4）GlcNAc，2型链结构），形成乳糖-N-新四糖（乳糖-N-新四糖，LNnT）。BMO和HMO中常见结构，如图1所示。

图1 BMO和HMO中常见结构

BMO和HMO所含单糖基可在1、2型链结构及乳糖核心上通过不同的糖苷键组成不同的直链或支链结构的低聚糖，BMO所具的N-乙酰乳糖胺单元核心上也可连接单糖基。两者至少有10种以上的共同低聚糖成分，但HMO有更多样化的结构[5]。在足月母乳中，35%～50%的HMO为岩藻糖基化，12%～14%为唾液酸化，42%～55%为非岩藻糖基化中性HMO。与HMO相反，BMO中具有的酸性低聚糖含量较中性低聚糖多:在BMO中，唾液酸基化低聚糖较丰富，岩藻糖基化低聚糖极少；而HMO中岩藻糖基化低聚糖较丰富[3]。但由于BMO和HMO部分成分的重叠，使得从BMO中提取部分结构的低聚糖添加至母乳代替物如配方奶粉中提供了可能。

2 BMO的功能活性

2.1 对肠道健康及免疫系统发育的影响

2.1.1 肠道有益菌的益生元作用，维系肠道健康

BMO作为益生元，主要促进母乳喂养婴儿肠道中常见的优势菌益生菌，如双歧杆菌等在婴儿肠道内的生长，改善婴儿健康状况。同时，BMO的聚合度一般较小，更易于双歧杆菌的代谢，促进益生菌增殖作用较HMO更优[8]。此外，双歧杆菌在肠道内的代谢产物有短链脂肪酸（SCFA）、B族维生素、叶酸等，可改善婴儿的生长发育如提高肠道细胞能量供应、增强免疫、预防炎症和过敏等[4]。

短链脂肪酸（SCFA），是胃肠道厌氧细菌微生物群如双歧杆菌属、类杆菌属[9]等发酵的产物，产生的SCFA主要为乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，通常存在于结肠中，浓度相对较高，并被肠上皮细胞吸收。这些细菌代谢产物可在结肠中形成低pH环境，抑制潜在病原体并利于有益细菌的生长。如双歧杆菌在体外厌氧发酵期间有效地消耗2’-FL和3’-FL，显著增加了乳酸和SCFA的浓度，抑制了难以使用岩藻糖基化低聚糖的大肠杆菌和产气荚膜梭菌的生长[10]。在一项随机双盲对照多中心临床试验中[11]，发现经过3个月的干预后，含有2′-FL和LNnT的婴儿配方奶粉显著增加了双歧杆菌和链球菌的丰度，并将0～6个月大的剖腹产婴儿组的微生物群改变为类似阴道分娩婴儿的微生物群[12]。

2.1.2 影响免疫系统功能，预防炎症和过敏

一般来说，肠道健康和屏障功能被认为是先天免疫的第一道防线，BMO通过婴儿肠道微生物群和上皮屏障等可影响先天免疫功能,预防炎症及过敏等免疫疾病。

在肠道细菌的持续接触、定植和刺激黏膜上皮表面的过程中，婴儿小肠黏膜免疫系统逐渐成熟，某些益生菌可通过直接刺激肠黏膜固有层的免疫细胞来诱导免疫系统成熟。例如，双歧杆菌可刺激免疫细胞分泌更多的IL-1和IL-6，从而直接诱导T淋巴细胞的增殖，促进辅助性T细胞分泌IL-2以及促进B淋巴细胞的分化、成熟和分泌抗体[13]。

同时，双歧杆菌发酵的产物SCFA被用作多种宿主代谢过程的底物，每种SCFA对婴儿健康都有其特殊的功能:乙酸和丙酸被认为可以降低婴儿哮喘的风险[12]；丁酸可以刺激肠上皮代谢，稳定缺氧诱导因子（HIF），增强肠上皮的屏障功能，降低便秘和腹泻的风险[14]。同时，丁酸还是结肠细胞的首选能源[15]，在肝脏和结肠中起到抗炎作用[16]：丁酸可增强调节性T细胞（Treg）的活性和增殖，抑制多种免疫细胞的促炎症活性[16-17]。

BMO和HMO所含部分组分低聚糖具有抗炎作用：如岩藻糖基化低聚糖，可作用细胞信号通路，影响炎症因子表达，从而减少新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）等炎症发生[18]。又如唾液酸化的低聚糖，可以通过降低白细胞对内皮细胞的黏附，从而减轻炎症反应[19]。

对过敏小鼠模型的实验表明，口服2'-FL可减少炎性细胞因子TNF-α、IL-4、IL-6的产生，促进miR-146a的表达，并减少β-乳球蛋白(β-LG)诱导的血清特异性IgE分泌和肥大细胞脱颗粒。2'-FL降低β-LG过敏的免疫调节作用可能与调控miR-146a抑制TLR4/NF-κB信号通路有关[20]。新生儿摄入2’-FL的含量较高时，可降低成长期间IgE相关过敏表现，如湿疹的风险[21]。

2.2 抗细菌和病毒黏附的诱导受体

BMO可作为诱导受体，直接抑制致病菌、病毒对正常细胞的吸附、结合，从而减少疾病如呼吸道感染、急性肠胃炎等的发生[22-23]。

呼吸道感染（RTI）为婴幼儿常见疾病，最常见的感染包括肺炎、急性中耳炎、鼻窦炎和支气管炎等，通常由病毒和/或细菌病原体引起的。超过30%的肺炎相关死亡是由革兰氏阳性病原体肺炎链球菌引起的，负责将肺炎链球菌附着到人类鼻咽上皮细胞的受体之一是GlcNAc（β1-3）Gal。该受体与低聚糖乳糖-N-新 四 糖（Gal（β1-4）GlcNAc（β1-3）Gal（β1-4）Glc，LNnT）等唾液酸化低聚糖具有相似性，LNnT、3’-SL、6’-SL可以作为肺炎链球菌天然受体的诱饵，竞争性抑制肺炎链球菌对呼吸道上皮细胞的黏附[24]。3’-SL、6’-SL还能抑制铜绿假单胞菌与人肺细胞的黏附[25]。

人类诺如病毒（Norovirus），通常是急性肠胃炎爆发的主要原因。诺如病毒与组织血型抗原(HBGA)的相互作用对感染很重要。2'-岩藻糖基乳糖(2'FL)可模拟HBGA,充当受体诱饵,抑制诺如病毒与HBGA的结合[26]。

2.3 促进大脑发育

BMO和HMO可促进大脑发育水平，如学习、记忆认知和情绪、行为反应的改善[27]。摄入BMO和HMO的幼猪，区域脑容量和海马mRNA表达改变，识别记忆等大脑功能得到改善，但BMO和HMO两者可能通过不同的机制对大脑结构和认知能力有不同的影响[28]。

摄入2'-岩藻糖基乳糖（2′-FL）会影响中枢神经系统(CNS)功能，例如增加海马长时程(LTP)及增强大鼠的学习和记忆[29]，与对照组相比，哺乳期口服2'-FL的大鼠在新物体识别和Y迷宫中的表现明显更好[30]。2′-FL对CNS功能的影响之一是通过肠脑轴(GBA)介导的，这种影响依赖于迷走神经的完整性[29]。

唾液酸参与多种分子糖基化的过程，可被脑细胞利用以形成神经节苷脂和唾液酸化蛋白，例如神经细胞粘附分子(NCAM)和脑源性神经营养因子(BDNF)[31]。故唾液酸基化的低聚糖，可以通过促进神经系统细胞的增殖和发育等，来维持婴儿大脑的正常发育。例如，用3'-唾液乳糖（3'-SL）或6'-唾液乳糖（6'-SL）喂养小鼠有助于维持正常的结肠微生物群落结构和非焦虑行为[32]。

3 BMO的生产应用

3.1 生产概况

多年来，分离或合成具有特定分子结构的BMO和HMO应用于婴儿配方奶粉一直比较困难。较常见的是，使用植物源性低聚糖如低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）等来模拟BMO和HMO，添加到婴儿配方奶粉中。然而，这些低聚糖不能完全模拟结构特异性BMO和HMO的效应和生物功能[33]。例如，与FOS相比，2′-FL在降低肠道pH值和SCFA生成方面具有优势，双歧杆菌和乳酸杆菌会优先利用2′-FL在婴儿肠道定植并形成优势菌。GOS可被包括致病菌在内的各种细菌非选择性地利用[34]。

BMO和HMO在婴儿健康和发育中的重要性，刺激了全世界对BMO、HMO或其活性类似物合成和制造的研究及商业关注。目前，用于合成BMO和HMO的方法包括化学酶、细胞工程和化学合成工艺等取得了重大进展，如使用糖苷酶、糖基转移酶[35]或微生物发酵[36]的策略合成部分BMO和HMO，包括2′-FL、3′-SL、6′-SL、LNT、LNnT、DFL（二岩藻糖乳糖）等。

为了实用且经济可行地获得多样结构性的BMO和HMO，更好地了解它们的结构并进一步探索生物学功能与生产应用，现也有使用大规模的膜过滤操作将它们与乳制品流分离的技术：牛初乳是丰富的BMO的来源，但目前牛初乳的主要工业用途是生产富含免疫球蛋白的高价值浓缩物，如奶酪。奶酪生产过程中，非酶蛋白和极性分子（如盐、乳糖和BMO）会作为乳清被去除，乳清蛋白纯化产生的液体副产品，称为奶酪乳清渗透液，通常被视为废物流和环境污染物。BMO在乳清蛋白制造的副产品乳清渗透液中的含量和浓度较高，因此可以从中提取营养价值高的BMO[36]，增加乳清渗透液流的价值，提高乳品业的持续利用。

例如，开发了从乳品流中利用膜过滤分离寡糖的中试优化技术，从初乳中完成乳糖水解和单糖发酵后，对发酵乳清渗透液进行纳滤，可减少不需要的单糖和双糖的含量，高纯度回收95%的低聚糖[37]。另外，膜过滤技术和酶促系统添加岩藻糖和唾液酸的联合应用新策略可使BMO合成类HMO的产品，成为改善婴儿配方奶粉功能的高价值成分[35]。

3.2 商业应用

2015年，欧洲食品安全管理局批准使用含2′-FL和LNtin的婴儿配方奶粉和其他婴儿食品，规定在婴儿食品中以2∶1的比例，最大剂量为2′-FL（1.2 g/L）和LNnT（0.6 g/L）添加2′-FL和LNnT对1岁以下或1岁以上的婴儿是安全的。2019年，美国食品和药物管理局（FDA）规定，0至12个月大的婴儿配方奶粉中2′-FL的最大剂量为2.4 g/L，LNnT的最大剂量为0.6 g/L。同年，澳大利亚和新西兰食品标准局（FSANZ）建议添加2′-FL和LNnT时，LNnT的最大剂量为24 mg/100 kJ，2′-FL和LNnT的最大总剂量为96 mg/100 kJ。

监管和专业机构制定的有效官方标准保障了婴儿配方奶粉和其他婴儿食品的安全性和营养质量，同时也开拓了BMO和HMO的商业应用道路。例如：2018年，Glycosyn公司在收到FDA的GRAS监管批准通知后生产了2′-FL、LNT和DFL，Genechem生产了3′-SL等。一些婴儿乳品行业公司已获得大规模生产低聚糖的能力，并补充添加入婴儿配方奶粉中，带来革命性的变化。

2016年第一批相关婴儿配方产品出现，其后更多的产品不断涌现：如，雅培将2′-FL应用于婴儿配方奶粉（SimilacRProAdvance）；Aptamil将2′-FL和3′-GL与FOS和GOS组合应用添加;惠氏将0.25 g/L的2′-FL添加入S-26R婴儿配方奶粉，2′-FL和LNnT添加入lluma系列的婴儿配方奶粉1-4段中。此外，美赞臣、雀巢等婴儿乳品公司也将低聚糖应用于其婴儿配方奶粉产品[37]。

4 前景与展望

在国外，牛乳低聚糖(BMO)和母乳低聚糖（HMO）在婴儿营养与健康中的功能和应用取得了重大的研究进展和技术突破，向功能食品和母乳替代品如婴幼儿配方奶粉中添加具有自然非特异性免疫调节作用的低聚糖来调节肠道微生物群、增强免疫力，已经成为保护儿童健康的成长发育以及调整成人身体功能的全新概念的添加剂的选择。

目前，国内关于牛乳低聚糖的研究和生产还处于初步阶段，对牛乳低聚糖的深入研究、开发，以及低成本的大量生产和广泛的应用还需要我们的努力。同时，BMO和HMO的抗菌、抗病毒功能以及通过调节肠道微生物群来预防肥胖、抑郁等疾病的作用或可进一步深入研究，以期开发成具有相关保健、治疗作用的辅助性食品或新型药物，故牛乳低聚糖有着非常重要的研究意义和广阔的应用前景。