高效液相色谱-荧光检测法测定大白菜中维生素K1含量

于翰宗，田 蒙，姜 山，程 斐，孙朝晖

（青岛农业大学园艺学院，山东 青岛 266200）

维生素K是具有凝血作用的2-甲基-1，4-萘醌及其衍生物的一类物质，包含有维生素K1、维生素K2、维生素K3、维生素K44种形式［1］。维生素K1是人体必需的健康营养素之一，对人体正常的生理机能运转具有重要影响，主要的生理功能是凝血，同时是人体内肝脏合成凝血酶原（凝血因子Ⅱ）、斯图尔特因子（凝血因子X）、转变加速因子前体（凝血因子Ⅶ）、血浆促凝血酶原激酶（凝血因子IX）所必需物质，激活凝血因子是机体凝血功能正常发挥的必要条件［2］。缺乏维生素K1能引发凝血因子异常或合成障碍，导致出血现象并延长凝血酶原，影响人体健康。近来有文献报道维生素K1还有预防癌症、预防血管钙化、参与骨代谢、抑制糖尿病性白内障、治疗毛细管支气管炎、解毒等［3-7］生理功能。维生素K1存在广泛，大部分来源于蔬菜，其中普通大白菜、西兰花、甘蓝等十字花科蔬菜含量均较高。

大白菜（Brassica rapaL.ssp.pekinensis）种植面积大，其产量在北方蔬菜中占较大比重。大白菜作为保健蔬菜，含有丰富的维生素和矿质元素。但对白菜中维生素K1含量的研究鲜见报道。相关研究中，高效液相色谱法、荧光法、色谱质谱串联法是维生素K1的主流检测方法［8-11］。通过高效液相色谱-荧光检测技术对活性成分进行定性定量的分析是目前相对效率高、反应灵敏、精准可靠的检测方式。维生素K1的传统前处理方法主要有酶解法、液液萃取法、皂化法等［12-15］。目前，固相萃取技术在试样分离、纯化、浓缩过程中回收率较高，操作流程更加简化，成为样品前处理的主流技术。本研究参考GB 5009.158—2016《食品安全国家标准食品中维生素K1的测定》［16］，探究利用高效液相色谱-荧光检测器检测不同球叶颜色的大白菜维生素K1含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料13份白菜样品采自青岛农业大学莱阳校区试验基地。

1.1.2 试剂 异丙醇、甲醇均为色谱纯，Thermofisher公司；正己烷为分析纯，杭州石化有限公司；二氯甲烷为色谱纯，天津市康科德科技有限公司；乙酸乙酯为色谱纯，Aladdin生化科技股份有限公司；氯化锌、无水乙酸钠为分析纯，广州化学试剂公司；99%维生素K1标准品，Sigma公司。

1.1.3 仪器LC-20A型高效液相色谱仪、Shinpack GIST C18色 谱 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、AUW-220型电子分析天平，SHIMADZU；XHC旋涡混合器，常州仪器制造有限公司；DTC-27J型超声波水浴锅，中国湖北鼎泰生化技术设备制造有限公司；锌粉还原柱（4.6 mm×50 mm，50～70 μm），上海安谱实验科技股份有限公司；HITACHI CT6E型离心机，日本日立有限公司；N-EVAP 11203030138型氮气吹干仪，美国Organomation公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取纯度99%标准品维生素K1油状液体20 mg于棕色容量瓶中，用色谱级甲醇分别溶解，定容至10 mL，混合均匀配制成2.0 mg/mL的单一标准储备溶液。使用标准移液枪准确移取母液于棕色容量瓶中，加入色谱级甲醇进行逐级稀释，配制成不同浓度（0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mg/mL）的单一标准品溶液，上机测定，记录峰面积。

1.2.2 样品制备、提取与测定 称取已打成匀浆的新鲜样品10 g（维生素K1含量不低于2 μg），加到具塞离心管中，加入40 mL异丙醇，盖上塞子，涡旋混匀后超声5 min，静置1 min。加入10 mL正己烷，涡旋振荡8 min，然后4 500 r/min离心5 min，用移液枪小心转移上清液至50 mL具塞离心管中。再次加入10 mL正己烷提取操作1次，然后加入正己烷定容至25 mL棕色容量瓶。用氮气吹干，正己烷定容至2.0 mL，待净化。

中性氧化铝柱经5 mL正己烷活化后，将上述2.0 mL正己烷定容液以1.0 mL/min流速过柱，用5 mL正己烷以1.0 mL/min流速淋洗柱子，后用7 mL正己烷溶液再次洗脱至10 mL试管中，氮气吹干后用1.0 mL甲醇复溶，经0.22 μm有机态滤膜过滤至1.5 mL液相进样小瓶中，待HPLC分析。

本研究根据实验室数据积累经验，改进自国标检测方法的流动相：使用甲醇900 mL、二氯甲烷100 mL、冰醋酸0.3 mL，混匀后，加入氯化锌1.5 g、无水乙酸钠0.5 g，经过超声溶解后，用0.22 μm有机系滤膜过滤。

1.2.3 精密度试验 按照样品溶液制备方法处理样品，制作5份用于检测样品含量的平行样品溶液，计算其峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.2.4 加标回收率试验 根据样品的实际测定数值，做加标试验方法准确度图表。准确称取预先混匀的维生素K1溶液1.0 mg（精确到0.1 μg），按含量0.5、1.0、1.5倍向供试品中加入维生素K1标准溶液（2.00 μg/mL），按供试品溶液制备方法处理加标样品，对每个测试品平行操作3份。

1.2.5 人为目测 将白菜从中间竖切，由视觉正常的4人分别独立观察白菜球叶颜色，将叶色按白色到黄色深浅分为5级。即：1，纯白；3，白色；5，浅黄；7，黄色；9，深黄。综合4人统计结果进行平行分析。

2 结果与分析

2.1 色谱图结果分析

利用高效液相色谱法检测白菜维生素K1含量出峰时间较快，为6.7 min，样品出峰时并不受其他杂质峰的影响，可准确分离和定量（图1）。

图1 维生素K1标准品（a）和白菜样品（b）色谱

2.2 可靠性

本研究层析柱的柱效比值为0.98；回收率为97.02%～109.1%；最小检出限为4 μg/100 g。相对标准偏差分别为0.118%、0.736%。可证明高效液相色谱-荧光检测法测定大白菜中维生素K1含量的结果准确。

维生素K1线性方程为Y=10.233x-1.813 3，R2=0.996 9，在浓度为0.229～6.197 μg/mL时，利用高效液相色谱-荧光检测法测定维生素K1含量的线性关系明显。

2.3 稳定性

测定供试品溶液峰面积及保留时间，计算相对标准偏差，结果见表1。维生素K1面积的RSD为1.228%，保留时间的RSD为2.350%，由此可见，在24 h内供试品溶液含量稳定。

表1 峰面积和保留时间稳定性结果

2.4 检出限

检出限及定量限分别以3倍和10倍信噪比（S/N）进行统计，结果表明，当取样量为1.5 g，总定容体积为500 mL时，维生素K1含量的检出限为0.29 μg/100 g，定量限为0.95 μg/100 g。

2.5 加标回收率

测定样品中维生素K1含量并计算其回收率。在3个加标水平下的回收率分别为97.5%、98.2%、101.8%，说明该方法测定K1含量可靠有效。

2.6 实际样品检测

取大白菜不同部位样品的均匀制样，共计13个品种，均来自莱阳试验基地，按照高效液相色谱-荧光检测法测定白菜中维生素K1含量，同时选取茎叶类、鲜叶类、菜花类、葱蒜类、半野生类、根茎类（非淀粉）、茄果类、鲜豆类等日常生活中常见蔬菜进行检测，并进行含量比较。结果显示，不同类型蔬菜维生素K1含量差别很大，对比表2和表3数值发现，大白菜维生素K1含量处于较高水平。由表3可以看出，大白菜不同部位的维生素K1含量差别较大，其中外叶白帮含量最低。球叶颜色越黄，维生素K1含量越高；在外叶绿叶部分，外叶颜色越绿，维生素K1含量越高。

表2 不同类型蔬菜维生素K1含量

表3 不同品种大白菜中维生素K1含量

3 小结与讨论

本研究建立了大白菜中维生素K1的分析检测方法。采用异丙醇和正己烷试剂，对大白菜样品去除叶绿素、类胡萝卜素等杂质干扰，能有效分离维生素K1，该方法出峰时间早、能有效分离杂峰、检出限高，是对大白菜中维生素K1进行检测的优选方法。由于顺式维生素K1几乎没有活性且蔬菜中维生素K1绝大部分为反式维生素K1，因此，本试验定量分析维生素K1，即可代表大白菜中对人体有效维生素K1含量。

人为目测是直接根据大白菜球叶颜色差异对人视觉的刺激反应进行评判、分级的方法，通过多人评定排除环境饰变，从而减少受环境的不稳定影响。人为目测虽然没有仪器检测精确，但也有较高准确性，并且易于操作，同时是当下大白菜育种中田间检测叶色相关性状初步选择的最常用方法。

对日常生活中常见蔬菜维生素K1含量进行检测，发现不同类型蔬菜维生素K1含量差别较大，纵向对比发现，蔬菜颜色越绿，维生素K1含量越高，同时大白菜维生素K1含量处于较高水平，尤其是外叶绿色部分含量最高，由此建议人们在日常生活中多食外叶绿色部分。

大白菜是人们普遍食用的蔬菜，中国营养学会建议中国居民维生素K1的适宜摄入量为120 μg/d［17］。本试验中，桔红65、27-1、ZC22-1、419-2、健美、喜诺6个黄心品种维生素K1含量均超过120 μg/100 g。大白菜中维生素K1含量丰富，尤其是绿色部分，同时结合徐超等［18］研究可以推断颜色越绿的蔬菜，维生素K1含量越高。在球叶为黄心的大白菜品种中，维生素K1的含量随着黄色程度加深而提高。这也为育种工作者选育黄色球叶大白菜提供了重要的品质性状参考。