新冠病毒药物研发新靶点—LLQY 基序

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的全球大流行带来了前所未有的世界公共卫生问题，也给世界经济发展造成了巨大的打击，同时也极大的推动了病毒学研究的发展。研究发现，新型冠状病毒（SARSCoV-2）是引起COVID-19 的唯一病原体，为β 冠状病毒属有囊膜的单股正链RNA 病毒。SARS-CoV-2 颗粒直径约60 nm～140 nm，呈球形或卵圆形，主要由刺突蛋白（S）、基质蛋白（M）、胞膜蛋白（E）、核衣壳蛋白（N）、RNA 依赖型RNA 聚合酶蛋白（RdRp）以及RNA 基因组构成，其中S 蛋白负责与受体结合并介导病毒进入细胞，是病毒感染的关键组分，也是目前疫苗和药物研发的主要靶点。

近日，《Journal of Virology》杂志发表了题为“The LLQY motif on SARS-CoV-2 spike protein affects s in‐corporation into virus particles”的研究论文，该研究发现，SARS-CoV-2 S 蛋白保守的753-LLQY-756 基序在S 蛋白的合成、加工及病毒组装和感染的过程中发挥着关键作用。有研究发现，SARS-CoV-2 S 蛋白前体在内质网中合成后转运至高尔基体，被高尔基体中的Furin 蛋白酶切割形成S1 和S2 两个亚基，并通过非共价键作用结合形成成熟的S 蛋白并参与病毒颗粒的组装。其中，S1 亚基主要与人血管紧张素转化酶2（hACE2）受体结合，S2 亚基将S 蛋白锚定在病毒膜上，同时介导病毒—细胞的融合过程。在S2 亚基的N 端存在跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）识别位点S2'，在S2 发挥融合功能的过程中，TMPRSS2 识别并切割S2'位点，暴露融合肽。该研究比较分析了大量SARS-CoV-2 S 蛋白的氨基酸序列发现，在S1/S2 切割位点与S2'切割位点之间存在一段高度保守的氨基酸基序。同时对S 蛋白三维结构的分析发现，这段保守的氨基酸基序中L753、Y756、F759与T998之间通过氢键相互连接形成稳定的空间结构，其中Y756位于中间，起到支撑作用，推测这种空间结构在维持S 蛋白融合前构象的过程中发挥重要作用。

为了进一步证实这一推测，该研究首先根据多种冠状病毒S 蛋白氨基酸的结构特征，对Y756进行了多种突变，结果显示，当酪氨酸（Y）突变为丙氨酸（A）、甘氨酸（G）、谷氨酸（E）时，细胞内的S 蛋白前体不能被裂解为S1 和S2 两个亚基，突变为色氨酸（W）、组氨酸（H）时，S蛋白前体的裂解水平降低，表明Y756突变会影响到蛋白酶对S1/S2 裂解位点的识别。随后该研究基于HIV-1 慢病毒包装系统，构建了Y756突变型假型病毒，感染试验结果显示，与野生型病毒相比，Y756突变的SARS-CoV-2 假型病毒感染表达hACE2 的293T 细胞（293T-hACE2）以及人肝癌细胞（Huh7）的水平均显著降低，对L753、F759以及T998突变后得到同样的结果，表明753-LLQY-759 基序的稳定对SARS-CoV-2 感染细胞至关重要。进一步研究显示，L753和Y756突变会导致S 蛋白的亚细胞定位发生改变，表明753-LLQY-759基序的稳定能够影响S 蛋白的正确转运。对L753和Y756均突变的SARS-CoV-2 假型病毒以及病毒样颗粒分别通过western blot试验以及透射电镜观察发现，这两个氨基酸位点的突变会影响S 蛋白插入到假型病毒或病毒样颗粒的囊膜中。最后该研究分析了753-LLQY-759 基序中单氨基酸突变包装的假型病毒对其受体结合区（RBD）诱导产生抗体中和活性的敏感性，结果显示，Y756突变使得SARS-CoV-2 假型病毒对RBD 诱导产生中和抗体的敏感性降低。

综上所述，该研究充分证明了SARS-CoV-2 S 蛋白中的753-LLQY-759 基序通过影响S 蛋白的加工、成熟以及转运过程，从而影响病毒粒子的组装和产生。因此，该保守的基序或可作为广谱抗冠状病毒药物设计和研发的潜在靶点，对于防控和治疗新型冠状病毒肺炎策略的研究有重要的借鉴意义。