轮状病毒感染宿主的Toll样受体信号通路研究进展

叶丽萍，胡静涛，石春卫

（吉林农业大学动物医学院/吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林 长春 130118）

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属的双链RNA 病毒，是引起婴幼儿和其他幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一。RV 感染主要侵入肠道绒毛上皮细胞从而导致细胞空泡变性、小肠绒毛萎缩脱落和肠壁变薄等症状以致腹泻发生。RV 感染宿主肠上皮细胞可被不同的模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）特异性识别，而Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为宿主免疫系统中重要的PRR，其在RV 感染并诱导树突状细胞（Dendritic cells，DCs）成熟及激活固有免疫应答的过程中发挥重要作用。本文较全面探究了RV 感染与宿主TLRs 信号通路的互作机制，将有助于了解宿主抗RV 感染的固有免疫反应，为RV 感染的防控和治疗提供新思路。

1 与RV 感染相关的TLRs

TLRs 是免疫细胞中主要的跨膜蛋白，在病毒和细菌的感染与识别中具有重要作用，是连接机体固有免疫和获得性免疫反应的桥梁[1]。目前在哺乳动物中共发现了15 个TLRs（TLR1～TLR15），其中人类共有11 个TLRs[2]。不同的TLRs 识别不同的病原体相关模式分子（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）[3]，如TLR1 识别细菌脂蛋白和三酰脂质肽；TLR2 识别革兰氏阳性菌糖肽；TLR5 识别鞭毛蛋白；而TLR3 能特异性识别病毒感染的中间产物dsRNA[4]和poly(I:C)，促进炎性细胞因子和I 型干扰素的产生。在 众 多 的TLRs 中，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 和TLR9 参与识别病毒和抗病毒感染的固有免疫反应，其中TLR2 和TLR4 位于细胞膜表面参与识别病毒糖蛋白，TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 位于细胞内参与识别病毒核酸，诱导宿主产生I 型干扰素[5]。

哪种或哪几种TLRs 参与RV 感染后的病毒识别及抗病毒的固有免疫应答，目前尚无定论。RV 感染后单核细胞所表达的TLRs 识别dsRNA，激活NF-κB和干扰素途径，进而导致多种细胞因子及辅助刺激分子的分泌，以调节机体非特异性免疫应答[6]。Xu等研究RV 严重感染的腹泻儿童的外周血单核细胞发现，发病3 d 内有41% 的患者体内TLR2～TLR4、TLR7和TLR8的mRNA 转录水平升高；3 d 后只有TLR3和TLR8基因mRNA 转录水平保持较高水平[7]。RV 感染人肠上皮细胞（HT29）细胞24 h～48 h 只有TLR4基因转录水平轻微上调，而TLR2、TLR3、TLR7和TLR8基因的转录水平则随着感染时间的延长而显著升高，提示TLR4 在RV 感染的免疫应答中并未起主要作用[8]。Pott 等的研究表明，RV 感染导致小鼠肠上皮细胞中TLR3基因的转录水平明显升高，而TLR3缺失成年小鼠的肠上皮细胞分泌抗病毒或促炎性细胞因子则明显减少[9]。Lopez-Guerrero 等则认为病毒感染后TLR3、TLR7 和TLR9 可能参与了宿主的固有免疫应答[10]。恒河猴轮状病毒（Rhesus monkey rotavirus，RRV）刺激非肥胖糖尿病（Non obese diabe-tes，NOD）小鼠的脾细胞，可诱导抗原递呈细胞（An-tigen presenting cell，APC）和B 细胞的活化，从而干扰TLR7 或干扰素α 受体（Interferon alpha receptor，IF-NAR）的信号通路；而感染RRV 的NOD 小鼠的浆细胞样树突状细胞（Plasmacytoid dendritic cells，pDCs）则能够触发TLR7 信号通路的活化[11]。Vlasova 等用鼠李糖乳杆菌GG 株免疫SPF 仔猪，再进行RV 攻毒试验的结果显示，攻毒后小鼠的TLR3基因转录水平上调，而TLR2和TLR4基因的转录水平下调[12]。本研究室检测猪轮状病毒（PRV）感染的小鼠骨髓树突状细胞（Murine bone marrow-derived DCs，BMDCs）发现，其中的TLR2和TLR3基因的转录水平均随作用时间的延长而上调，而TLR4和TLR8基因的转录水平均低于对照组，表明TLR2 和TLR3 可能参与PRV 感染BMDCs 的免疫应答，而TLR4 和TLR8 在PRV 感染后并未起主要作用[13]。

2 与RV 感染相关的TLRs 途径

TLRs 通过病原体相关分子模式（Pathogen-associ-ated molecular patterns，PAMP）与β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）、TLRs 接头蛋白髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）、TIR 结构域衔接蛋白（TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP）、TIR 结构域衔接分子2（TIR domain-contain-ing adaptor molecule 2，TICAM2）等结合，激活下游NF-κB 和干扰素调节因子3（Interferon regulatory fac-tors，IFR3）等参与宿主的固有免疫应答[14]。MyD88和TRIF 是TLRs 信号通路中2 个重要的接头蛋白，TLRs 通过MyD88 依赖/非依赖型信号途径活化NFκB，并分泌多种炎症因子产生抗病毒的免疫应答。

2.1 MyD88 依赖型TLRs 信号转导的通路MyD88包含N 端DD、中间结构域ID 和C 端Toll/IL-1 受体结构域，其通过C 端结构域与TLRs 结合，激活NF-κB和促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated pro-tein kinases，MAPK）信号通路，诱导促炎性细胞因子的分泌，该途径属于MyD88 依赖型TLRs 信号转导通路[15]。TLR-MyD88/IRAK-NF-κB 诱导激酶（NIK）/NF-κB 和TLR-MyD88/IRAK-MAPK 信号途径，均能够促进DCs 分泌MHC I 和MHC II 类分子，从而诱导促炎性细胞因子（如TNF、IL-6、IL-1 等）和趋化因子（如CCL4）等的表达[16]。

MyD88缺失小鼠的小肠上皮细胞对RV 易感，导致RV 的传播能力增强，机体的免疫应答水平降低，IL-β 和IL-18 的转录水平无明显变化，表明RV 感染后小鼠的MyD88 信号通路是参与其固有免疫反应的关键[17]。Walther 等的研究结果显示， RRV 感染MyD88缺失的小鼠，小鼠全部死亡，其肝脏中IFNγ 和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNFα）的转录水平与对照组无明显差异，表明其免疫应答水平较低[18]。RRV 感染小鼠的胆管细胞能分泌高水平的迁移率族蛋白B1（High mobility group protein box-1，HMGB1），HMGB1 通过TLR2 和TLR4 可以诱导活化NK 细胞，与野生B6 小鼠比较，TLR基因缺失的成年小鼠可通过HMGB1-TLRs-MAPK 信号通路升高CD69、TNF-α 和IFN-γ 的基因转录水平[19]。上述结果表明，MyD88基因缺失小鼠对RV 感染的敏感性可能增加，这可能与小鼠机体内的微生物群与RV感染复杂的相互作用有关[20]。RV 感染后，宿主MyD88 介导的TLRs 信号转导通路能够抑制病毒的感染与传播，但MyD88基因缺失小鼠能否直接识别RV的成分尚不清楚。

2.2 MyD88 非依赖型TLRs 信号转导的通路MyD88非依赖型TLR 信号转导通路又称TRIF（IFN-β）依赖型信号转导通路。与TLR2、TLR7、TLR8 均属于MyD88依赖型信号通路不同，TLR3属于TRIF依赖型的TLRs/NF-κB 信号通路，诱导NF-κB 的活化。而TLR4 却有MyD88 依赖型和TRIF 依赖型两种信号通路[21]。

TLR3 被蛋白酪氨酸激酶磷酸化后募集TRIF，活化的TRIF 从TLR3 中分离出来，通过与肿瘤坏死因子受体作用因子3（TNF receptor associated factors 3，TRAF3）和TRAF6 相互作用并向下游传递信号，诱导IRF3 和NF-κB 的活化，促进炎性细胞因子的表达。TLR3 募集TRIF 有两条信号通路：一是TRIF 的氨基端与TRAF6 的梭基端结合，再与受体蛋白激酶1（Receptor interacting protein kinase 1，RIPK-1）相互作用，从而诱导NF-κB 的活化；二是磷酸化的TRAF3、二聚化的Kappa B 抑制因子激酶（Inhibitor of kappa B kinase，IKK）与IRF3 结合，诱导I 型干扰素基因的表达[22]。

TRIF基因缺失小鼠的信号通路研究中，TLR4 激活IRF3 和产生IFN-β 的能力减弱，炎性细胞因子的分泌减少；而脂多糖刺激TRIF和MyD88基因双缺失的巨噬细胞，NF-κB 的活化和炎症细胞因子的表达均受到抑制[23]。Bagchi 等研究牛RV 与HT29 细胞的相互作用机制发现，RV 感染4 h 即可在HT29 细胞中检测到肿瘤坏死因子受体作用因子2（TRAF2）的降解，但在非结构性蛋白质1（Nonstructural protein 1，NSP1）突变株感染RV 的HT29 细胞中并未检测到TRAF2 的降解，表明NSP1 通过降解TRAF2 的作用，抑制NF-κB 的活化和IFN 的表达，导致RV 的增殖且逃避宿主的固有免疫反应[24]。本研究室检测PRV 感染48 h 的TRIF基因缺失小鼠肠系膜淋巴结（Mesenter-ic lymph node，MLN）中MyD88、NF-κB、TRAF3和TRAF6基因的转录水平，结果显示TRIF基因缺失抑制了NF-κB和TRAF3基因的转录水平，但对MyD88和TRAF6基因的转录水平影响较小，减弱了MLN 中DCs 向不同亚群分化的能力，抑制MHC II 类分子和共刺激分子CD40、CD80 和CD86 的表达[25]。综上所述，TRIF基因缺失对TRAF3/NF-κB 信号转导通路有抑制作用，TRIF 及其介导的信号通路在抗RV 的感染中发挥重要作用。

2.3 与RV 感染相关的干扰素途径病毒感染可通过TLRs 和维甲酸诱导基因I 受体（RIG-I like recep-tors，RLR）通路启动IRFs，表达I 型IFN（IFN-α 和IFN-β）或II 型IFN（IFN-γ）参与抗病毒反应。RV 能促进鼠胚胎成纤维细胞和BMDCs 的活化，上调表达细胞表面标志，促进I 型IFNs 的产生。RRV 感染IRF3缺失小鼠的BMDCs 后，可通过IRF3 依赖途径调节I 型IFN 的表达，而TLR3和MyD88基因均缺失小鼠的BMDCs 表达的I 型IFNs 与对照组相同，表明这些反应不依赖TLRs 信号通路[26]。Hakim 等利用英夫利昔单抗阻断TNF-α 发挥作用，结果导致IFN-α 和IFN-β1 的表达量均降低，进一步研究表明TNF-α 具有潜在的抗RV 效应，而该效应是通过NF-κB 信号通路实现的[27]。不同RV 的NSP1 蛋白可降解不同的IRFs，人RV 的NSP1 主要通过降解IRF5 和IRF7 来抑制IFN 信号通路，而动物RV 的NSP1 主要通过降解IRF3、IRF5 和IRF7 来抑制IFN-β 的产生。与高剂量的IFN-γ 单刺激相比，IL-22 和低剂量的IFN-γ联合刺激诱导信号转导与转录激活因子1（Signal transducerand activator of transcription 1，STAT1）磷酸化的能力较强，表明IL-22 和IFN-λ 协作能够促进STAT1 的活化，从而抑制RV 的复制[28]。以上研究表明，III 型IFNs 在抗RV 感染的固有免疫反应中也起重要作用。

2.4 RV 感染后宿主的T 细胞、B 细胞免疫反应TLRs 可通过激活NF-κB 和IRF3 等诱导多种抗炎细胞因子分泌和I 型IFN 表达，激活固有免疫反应。婴幼儿急性RV 感染的血清中IL-6、IL-10 和IFN-γ 表达量明显增加，Th1 和Th2 类细胞因子均参与了宿主的免疫应答[29]，RV 感染通过MyD88 信号通路能够诱导宿主Th1 反应，MyD88基因缺失不能阻断IL-1β 和IL-18 信号的产生，导致RV 特异性IgA、IgG2 和IgG1的分泌减少[30]。细菌鞭毛蛋白能够预防小鼠感染RV，这是因为鞭毛蛋白能够通过DCs 表达TLR5/NL-RC4 途径，调节IL-22 和IL-18 的分泌[31]。RV 与人外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）相互作用时，PBMC 中的pDCs 减少了91%，结果导致IFN-α 的分泌量减少95%，IFN-γ 的分泌量也相应减少，表明pDCs 在刺激宿主产生RV 特异记忆性T 细胞中起重要作用[32]。

RV 感染小鼠小肠的pDCs 通过分泌I 型IFN（IFN-α 和IFN-β）调节B 细胞活化并参与免疫应答反应，利于RV 的清除[33]。RRV 能刺激宿主B 细胞的活化， 诱 导CD69 的 表 达， 但B 细 胞 的 活 化 需CD11c+DCs 的参与[34]。阻断TRIF 信号通路的传导或TRIF基因的缺失，细胞因子IL-6、IL-10、IL-12 和IFN-γ 的分泌量降低，DCs 分泌细胞因子和刺激T 淋巴细胞增殖的能力减弱[25]。上述结果表明，RV 感染时Th1 和Th2 型细胞因子均发挥作用，且急性感染后期以Th1 型细胞反应为主。

3 小结与展望

RV 通过影响与宿主TLRs 信号通路转导相关基因的表达，刺激宿主炎性细胞的分泌造成黏膜损伤，其NSP1 可通过降解宿主IRFs 来拮抗IFN-β 的产生，从而抑制STAT1、STAT2 和NF-κB 的表达，逃避宿主抗病毒的固有免疫反应。TLRs 下游基因的缺失也将影响RV 感染后宿主DCs 所诱导的黏膜免疫分子机制。阻断TRIF 信号可抑制TRAF3 和TRAF6 的泛素化过程，使NF-κB 的活化受阻，促炎细胞因子分泌的减少。本研究室利用TRIF 阻断剂（Pepinh-TRIF）阻断TLRs 关键接头分子的TRIF 信号后发现，PRV 感染小鼠BMDCs 的表型分化、基因转录以及细胞因子的分泌均受到影响，且抑制了TRAF3/NF-κB 信号通路的转导，表明TRIF 信号通路在抗PRV 感染中发挥重要作用（数据未发表）。进一步探究缺失MyD88基因或双阻断TRIF 和MyD88 信号通路后，RV 感染宿主DCs所介导的TLRs 信号转导通路的变化，对了解宿主抗RV 感染的固有免疫机制，促进RV 疫苗的研究有重要意义。