朊样蛋白Doppel的研究进展

王 川，俞海山，杨宇泽，魏亚琴，张 钊，万学瑞，贾晓蕊，吴 润

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.北京市畜牧总站，北京 100125；3.甘肃省科学院生物研究所甘肃省微生物资源开发利用重点实验室/厌氧微生物中心，甘肃 兰州 730000）

传染性海绵状脑病（Transmissible spongiform en-cephalopathies，TSEs）是由朊蛋白（Prion protein，PrP）引起的一种致命的神经退行性疾病，最早于18 世纪中期在欧洲地区羊群中发现羊瘙痒病，目前已在人和多种哺乳动物发现了传染性海绵状脑病[1-2]。现在普遍认为当人和哺乳动物的正常细胞型朊蛋白（Cel-lular isoform of prion protein，PrPC）发生错误折叠转变为痒病型朊蛋白（Scrapie isoform of prion protein，PrP-Sc）后导致传染性海绵状脑病的发生[3]。研究发现缺乏PrPC蛋白的小鼠对羊瘙痒症具有抗性[4]，此外PrPC在神经保护、神经传递、神经可塑性以及细胞死亡[5]，癌细胞的抗凋亡、耐药、迁移[6]，细胞抗氧化应激和DNA 损伤修复等多种生理功能中起重要作用[7]。Doppel 蛋白（Prion-like protein，Dpl）是在制备PrP 敲除小鼠研究朊蛋白相关功能过程中发现的朊蛋白家族成员，研究发现Doppel 在雄性生殖功能中发挥作用，同时Doppel 与癌症的发生也密切相关。Doppel与PrP 虽然二级结构相似，但是生理功能并不相同，甚至存在拮抗作用。本文就Doppel 蛋白的相关研究进行综述，为后续朊蛋白家族的研究提供参考。

1 朊蛋白家族及Doppel 蛋白

朊蛋白家族成员包括prnp基因编码的PrP 蛋白[8]，sprn基因编码的Shadoo 蛋白[8-9]，prnd基因编码的Doppel 蛋白[8-9]以及prnt基因编码的Prt 蛋白[8,10]。

1.1 朊蛋白prnp基因编码的朊蛋白广泛表达于在自然界多种动物机体，尤其在哺乳动物脑组织中高度表达，其编码的PrP 蛋白有两种构象，其中PrPSc是传染性海绵状脑病的病原体，另一种构象PrPC是一种GPI 锚定蛋白（GPI-anchored protein）锚定的膜糖蛋白，在人和动物全身多种细胞通路和信号传导过程中发挥作用[11]；由于PrPC由GPI 锚定蛋白锚定在细胞膜上并没有直接进入细胞，所以信号的转导不能够直接被PrPC调节，而是需要与其他跨膜蛋白相互作用来完成[12-13]；此外朊蛋白具有多种生理功能，不仅在细胞粘附、抗细胞凋亡等过程也发挥作用[14-15]，同时也在细菌感染过程中发挥重要作用，牛分枝杆菌感染导致prnp mRNA 表达水平逐渐升高且在感染过程中调控细胞凋亡[16]；而流产布鲁氏菌可利用肠道M 细胞上的PrPC作为一种侵入性受体[17]；在感染幽门螺杆菌患者的胃黏膜中PrPC高表达，但在未受感染的胃黏膜中不表达或低表达[18]；PrP 敲除小鼠在链球菌引起的细菌性败血症模型中显示易感性改变[19]；人的朊蛋白N 端重组蛋白也表现出了抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性[20]。

1.2 Shadoo 蛋白sprn基因是在公共数据库中搜索与prnd序列相似的核苷酸序列时发现的，随后在鱼类（斑马鱼、河豚）和哺乳动物（小鼠、大鼠、人类）中发现表达，其由两个外显子组成，整个开放阅读框（ORF）包含在第二个单外显子中，编码的Shadoo蛋白包含130～150 个氨基酸。Shadoo 和PrP 之间结构差异的主要是疏水C 末端和N 末端重复区域，但其总体结构与PrP 密切相关。通过哺乳动物（人、鼠、大鼠）的脑转录组，发现Shadoo 在脑中有显著的特异性表达，且两者之间功能上具有一定重叠，如中和Doppel 神经毒性以及神经保护作用[21]。

1.3 Prt 蛋白prnt基因又称睾丸特异性基因，编码睾丸特异性朊蛋白Prt，其在睾丸组织中高度表达，主要在生精细胞发育阶段的精原细胞和精母细胞的细胞核及精细胞和精子头部顶体区域中表达[22]；此外prnt在骨骼肌、乳房、附睾、小毛囊、大毛囊、子宫和卵巢中也有表达，而且在卵巢的表达量最高，其次是子宫、大卵泡和小卵泡[23]。

1.4 Doppel 蛋白

1.4.1 Doppel 结构prnd基因编码的Doppel 蛋白是在制备prnp基因敲除小鼠时发现的第一个朊蛋白家族成员，因其位于朊蛋白的下游而得名为Doppel 蛋白，具有179 个左右氨基酸残基；同时在小鼠、大鼠和人类中均发现了完整的prnd开放阅读框（ORF），小鼠prnd位于2 号染色体短臂prnp下游16 kb 处，包含3 个外显子和2 个内含子，ORF 位于第2 个外显子上，产生1.7 kb 和2.7 kb 两个转录产物[24]；小鼠神经母细胞瘤细胞中表达的Doppel 蛋白中存在两个N 端连接的糖基化位点，在细胞表面通过GPI 锚定蛋白锚定在细胞膜上[25]；小鼠和大鼠Doppel 蛋白同源性大于90%，小鼠和人类Doppel 蛋白同源性为76%；对重组PrP 和Doppel 蛋白结构进行比较研究，发现Doppel蛋白与已知的PrP 同源性为25%[24]；虽然两者的同源性并不高，但它们在翻译和修饰后的空间结构却十分相似[26]；鸡Doppel 与PrPC具有相似的翻译后修饰和空间结构，但两者表现为拮抗作用[27]；通过人工表达出小鼠的Doppel 和PrP 蛋白，发现两者整体的二级结构原件非常相似，都具有3 个α 螺旋和2 个β折叠，但α螺旋长度和β链方向之间存在差异[28]；在蛋白结构上，Doppel 存在2 个二硫键，而PrP 只具有1 个二硫键[25]；研究Doppel 和PrPC的糖基化和修饰是否相互影响发现，Doppel的修饰不受PrPC影响，而PrPC的N端短片段则因Doppel表达而减少[29]。

1.4.2 Doppel 生物学功能 研究表明prnp-/-小鼠的血管生成缺陷及中枢神经系统屏障完整性受损，Doppel 能促进血管生成和血脑屏障发育[30]；通过免疫印迹分析发现9 周龄的野生型小鼠各Doppel 在睾丸和心脏高水平表达，在脾脏和骨骼肌中表达较少，在脑、肾、肝和肺几乎不表达[31]； Doppel 在人类睾丸的支持细胞、附睾和成熟精子的鞭毛中均有表达；同时数据也表明，精子是研究Doppel 和PrP 之间潜在相互作用的有益模型[32]；Doppel 敲除的雄性小鼠在其精子发生过程中，圆形的精子细胞向有头有尾的精子转化是异常的，这阻碍了精子的发生，同时观察到后期分化的精子数量减少，成熟精子的结构也发生了异常，鞭毛和头部出现了畸形，顶体功能受损，导致不育[33]；在发育山羊的两性生殖细胞和胎儿睾丸间质细胞中都可以检测到Doppel 蛋白[34]；在育成绵羊睾丸中并未检测到Doppel，但在成年绵羊组织中发现了Doppel 的表达[35]；研究发现在ARR/ARQ 基因型绵羊大脑中Doppel mRNA 含量最高，神经组织中脑干中最低，ARH/ARQ 基因型绵羊丘脑中最高，脑干中最低，Doppel mRNA 在脾脏、扁桃体、下颌下淋巴结和咽部表达量中等，Prnp基因型对Doppel 基因表达的影响在ARR/ARQ 和ARH/ARQ 基因型绵羊相同组织中Doppel 基因转录水平差异显著[36]；在具有较高受胎率（SCR）的荷斯坦公牛精液中检测到了更高的Doppel mRNA 丰度[37]；通过克隆绵羊prnd并人工表达出Doppel 蛋白，在公羊精子获能过程中添加Doppel 蛋白，会显著提高精子的活力、生存能力和受精率[38]；已经证明PrP 和Doppel 还会由一些免疫细胞表达，特别是B 淋巴细胞、粒细胞和树突状细胞，细胞内转导信号的激活（即细胞内钙浓度和MAP 激酶途径的激活）表明PrP 和Dpl 与B 细胞上的功能受体结合，PrP 和Doppel 在免疫细胞间相互作用中可能发挥作用[39]；此外发现用牛源粪肠球菌和金黄色葡萄球菌感染BALB/c 雌鼠时PrP 和Dop-pel 的表达发生变化，其可能直接或者间接参与了小鼠机体抵抗细菌感染的过程[40-41]。

2 Doppel 与朊蛋白家族之间的互作

2.1 PrP 和Doppel研究发现PrP 的表达与DNA 修复之间存在联系，人类和小鼠神经元细胞中的PrP是DNA 损伤修复所必需的[7]；鸡PrPC下调可以抑制鸡MSB1 细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导G1 期细胞周期阻滞和凋亡[42]；而鸡PrPC过表达可促进鸡DF-1细胞的粘附、增殖、侵袭和迁移，但抑制细胞凋亡[43-45]；PrP 对氧化应激保护以及细胞自噬调节当中也发挥重要功能[46]；PrP 在动物神经组织中高度表达[47]，缺乏PrP 的小脑细胞对氧化应激更加敏感，并且比野生型细胞更容易发生细胞死亡[48]，细胞缺失PrP 时会增加细胞对氧化应激损伤的易感性[49]；越来越多的研究显示PrP 不仅具有保护正常神经元细胞的作用，而且还与癌症相关，PrP 过度表达与多种实体肿瘤的发生相关[50]，其与相关受体、生长因子等相关蛋白结合，通过调节肿瘤生长和分化而有助于肿瘤发生[51]，同时其也可抑制肿瘤细胞对凋亡刺激的敏感性[52]，抵抗细胞凋亡、促进细胞增殖并调控肿瘤的形成与发展[53]；此外也发现PrP 功能丧失和Doppel 异位表达是共济失调小鼠神经变性所必需的[54]，在prnp-/-的Nagasaki 和Rcm0 品系小鼠中过度表达prnd时，小鼠会表现出共济失调[24]，prnp-/-小鼠的Doppel 过量表达时，加剧了氧化应激而导致血红素加氧酶（HO-1）和一氧化氮合酶（NOS）参与的反应发生[55]；Doppel 过度表达所引起的细胞死亡和共济失调可以通过PrP 的同时表达来抵消[56]；并且PrP 的缺失对于Doppel 诱导细胞死亡是必需的[57]，表明PrP与Doppel 存在拮抗作用。Doppel 在N2a 细胞（小鼠脑神经瘤细胞）中诱导氧化应激，产生活性氧（ROS），诱导细胞活力降低，诱导细胞凋亡[58]；BEHRENS 等提出PrP 和Doppel 两种蛋白之间作用的竞争模型，PrP 与PrP 配体之间存在相互作用，在不存在PrP 的情况下，Doppel 与PrP 配体结合可能会触发神经元细胞凋亡，但如果PrP 对PrP 配体亲和力高于Doppel，则会优先结合PrP 配体，阻止Doppel 的凋亡信号[59]。

2.2 Shadoo 和Doppel通过构建sprn过表达小鼠来研究Shadoo 在成年小鼠其他组织中的表达，发现这种转基因只在睾丸间质细胞和卵泡颗粒细胞中持续表达[60]；而构建sprn-/-胚胎和sprn-/-小鼠发现，胚胎致死率显著增加，且sprn缺失的幼崽生长迟缓、雌性哺乳缺陷，同时转录组分析表明Shadoo 参与小鼠胚胎和乳腺发育和分化，且PrP 和Shadoo 在早期胚胎发育中有拮抗作用[61]；通过prnp-/-小鼠小脑颗粒细胞培养物中进行功能测定以及对哺乳动物脑组织转录组，发现Shadoo 在脑中有显著的特异性表达[21]，且其和PrPC一样也能够对Doppel 拮抗，可消除Dop-pel 的神经毒性[62]。

2.3 Prt 和Doppel通过体外受精过程中加入阻断Prt 功能的抗体的研究，发现受精率显著降低[63]，其可能在精子发生、分化、获能以及受精过程中发挥作用，而其与Doppel 的相互作用鲜有报导。

3 Doppel 蛋白在癌症方面的研究

大量研究发现Doppel 与癌症的发生密切相关，Doppel 表达程度与星形细胞瘤的恶性程度呈正相关[64]。研究白血病细胞系HL-60、K562 以及44 例急性髓系白血病（AML）和63 例骨髓增生异常综合征（MDS）（其 中 包 含RA、RARS、RAEB、RAEB-t、CMML）患者的骨髓细胞，并将健康非血液病样本的骨髓细胞作为对照。免疫印迹试验结果发现MDS 样本Doppel 表达比正常对照骨髓样本更强；荧光定量PCR 检测结果显示，正常对照组prndmRNA 转录水平最低，RA、RARS 样本中Doppel 基因的转录水平也 显 著 增 高，RAEB、RAEB-t、CMML 以 及AML 样本中也明显升高，RARS 和CMML 病例中Doppel 基因的转录水平最高，HL-60 细胞系中Doppel 的转录水平中等程度的上调，K562 细胞系中Doppel 的转录水平与正常对照相似。证实了Doppel 在AML 和MDS 骨髓样本中均表达，健康对照样本中均不表达或几乎检测不到[65]；利用prnd探针通过Northern 印迹杂交研究发现，健康人脑组织中prnd不表达，在多形性胶质母细胞瘤肿瘤组织和人脑星形细胞瘤细胞系PRTHU2 中高表达[66]；利用反义RNA 和小干扰RNA 来减少IPDDC-A2 星形细胞瘤衍生细胞系中Doppel 的表达，通过划痕伤口愈合实验发现Doppel 沉默后细胞迁移减少；在Hela 细胞中通过转染诱导Doppel 表达，与对照细胞相比，过表达Doppel 的细胞迁移率显著增加，说明Doppel 影响细胞的体外迁移能力[67]；分析星形细胞瘤标本、健康睾丸和大脑组织Doppel 表达，结果显示在大脑胞质和微粒体部分以及睾丸细胞质中均检测不到Doppel，而在86%的星形细胞瘤标本中检测出了Doppel[68]；Doppel 在各种肿瘤发生的血管生成过程中普遍表达，对人类癌组织进行评估发现，在肺癌和结肠癌样本中Doppel 强烈表达。对18 个非小细胞肺癌（NSCLC）和32 个结肠癌以及18 个肺和1 个结肠的正常组织进行Doppel 表达的检测发现，有83%的NSCLC 和78%的结肠癌样本显示Dop-pel 表达增加；通过荧光定量测定小鼠血管生成性鳞状细胞癌7（SCC7）分离出的肿瘤内皮细胞发现其Doppel 表达量比正常内皮细胞高38 倍，脉管系统在原发性肿瘤中表达高水平的Doppel；Doppel 仅在发育中的小鼠大脑和视网膜及新生的一些血管内皮细胞中表达，但在成年中枢神经系统的内皮细胞中表达减少，通过与血管内皮细胞生长因子受体2（VEG-FR2）相互作用激活内皮细胞的信号通路[43]；建立Doppel 过表达肿瘤模型并追踪Doppel 的表达和血管形成过程发现，在肿瘤内皮细胞中的Doppel 同样促进VEGFR2 信号传导[69]；Doppel 在肿瘤细胞和组织的表达说明其在肿瘤形成过程中发挥着重要作用。

Doppel 作为朊蛋白家族的一个成员，但目前研究表明Doppel 与传染性海绵脑病的发生并不相关。然而已有研究显示Doppel 与癌症的发生以及在细菌感染的感染相关，其具体机制还需要大量研究来阐明，从而为癌症和细菌病的研究和治疗提供新的思路和方法。