非洲猪瘟病毒入侵细胞机制的研究进展

彭国瑞，邹兴启，徐 嫄，徐小艾，朱元源，赵启祖，刘业兵

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193；3.中国科学院微生物研究所，北京 100101)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病。ASFV可以感染家猪、野猪和钝缘蜱等。自2018年8月辽宁省报告我国首例非洲猪瘟疫情[1]以来，非洲猪瘟已给养猪业造成巨大经济损失[2]。到目前为止，针对ASFV还没有有效的疫苗和抗病毒策略。ASFV是一种有囊膜双链DNA病毒，粒子直径约250 nm，呈正二十面体对称结构，中央是包含基因组的核心结构，被一层含有多种蛋白成分的核壳包裹，紧接着向外延伸，分别是内脂膜，二十面体蛋白衣壳和最外层的外脂膜[3]。巨噬细胞是ASFV感染的主要靶细胞，体外经适应后可在PK15、Vero细胞和其他细胞上生长[4]，病毒通过吸附、穿入和脱壳在细胞内完成复制、组装及子代病毒颗粒的释放。本文就ASFV入侵细胞的有关研究进展进行了综述。

1 病毒的吸附

1.1 受体介导的吸附 一般认为病毒颗粒感染细胞的首要条件是吸附细胞表面的受体。Alcamí A等[5]通过定量电子显微镜形态学分析发现，ASFV在感染的早期通过受体介导的内吞机制进入Vero细胞。之后，又用3H标记的ASFV与细胞结合，发现在质膜上存在饱和结合位点，从而使ASFV能够在Vero细胞中启动生产性感染。利用相同的方法，对于天然宿主巨噬细胞，病毒与细胞特定的饱和部位结合，通过受体介导的内吞机制进入细胞[6]。在平衡状态下，结合数据Scatchard分析表明，每个细胞大约有104个细胞受体位点，解离常数(Kd)为70 pM[7]。通过ASFV与非易感动物的巨噬细胞相互作用试验发现，ASFV颗粒可以利用非饱和结合位点介导进入兔巨噬细胞，并能够合成一些早期病毒蛋白，但病毒DNA合成没有发生，病毒复制被终止，提示这些细胞中不产生生产性感染，可能与缺乏特异性受体有关，并在其他不易感动物的巨噬细胞中也发现了类似的流产感染[8]。

1.2 病毒上的粘附蛋白 用非离子洗涤剂处理ASFV颗粒，释放出蛋白p12(p17经巯基乙醇处理后)能够与Vero细胞结合，不能与非洲猪瘟不易感的细胞结合，并且这种结合能够被病毒颗粒特异性的阻断，由此认为p12作为粘附蛋白参与细胞受体的识别[9]。然而，尽管通过自然感染和接种灭活病毒或重组蛋白p12的动物，可以诱导出针对p12蛋白的特异性抗体，但这些抗血清不能抑制病毒与宿主细胞的结合或中和病毒的传染性[10]。此外，位于病毒颗粒类脂外膜的结构蛋白p54、p30能够与猪肺泡巨噬细胞结合，用康复期猪或用重组p54或p30免疫猪获得的抗体，能够特异性的抑制这些蛋白与细胞的结合，同时，在易感细胞上p54和p30有着不同的饱和结合位点，且以剂量依赖的方式独立地阻止病毒感染。用重组p54或p30蛋白的抗体，可以抑制病毒对易感细胞的附着或内化。然而，对免疫后的猪攻毒并没有实现保护，病程也没有改变。与此相反，用p54和p30蛋白组合免疫猪可以刺激产生对病毒的中和效应，并极大地改变病程，从延迟发病到完全阻止病毒感染产生了不同程度的免疫保护。p54阻断了病毒颗粒与巨噬细胞的特异性结合，而蛋白p30阻断了病毒的内化，二者都有助于抗体介导的保护性免疫反应[11]。

1.3 细胞上的膜蛋白受体 目前，对于ASFV的细胞受体仍不明确。鉴于p12与病毒吸附Vero细胞相关，用不同的酶和凝集素处理细胞表面，其中有几种蛋白酶能够抑制p12与细胞的结合，但没有糖苷酶或脂肪酶，因此推断该细胞受体由蛋白质组成，而没有碳水化合物或脂类参与病毒的吸附；受体活性的恢复需要合成新的蛋白，而不是糖基化，因此，ASFV的受体是一种细胞表面的膜蛋白[12]。有学者就推测巨噬细胞标记物CD163可能是受体，用抗CD163的抗体作用巨噬细胞可以抑制ASFV，但对巨噬细胞上完全敲除CD163的猪，攻击ASFV基因2型的Georgia 2007/1株后，敲除型猪和野生型猪都被感染，临床症状、死亡率、病理或病毒血症等都没有差异；体外感染巨噬细胞试验也没有差异[13]，这项研究排除了CD163在ASFV感染中的重要作用。

2 病毒的穿入

病毒的吸附穿入是一个能量依赖的过程，可以通过多种方式进行；即便是同一种病毒也可以采用不同的内吞方式，这取决于细胞的类型、病毒的多样性和生长条件。目前，对于ASFV进入细胞的方式仍存在很多争议，包括依赖液泡pH和温度的受体介导内吞[5]，或是通过网格蛋白(clathrin)介导内吞，还有人认为除了受体介导内吞外，病毒还可以同时以吞噬作用(phagocytosis)[3,14]或是大型胞饮(macropinocytosis)[4,15]进入细胞。

2.1 网格蛋白(clathrin)介导的内吞 Valdeira M L 等[16]利用电镜研究ASFV与Vero早期相互作用时，发现病毒粒子附着在细胞表面后，被内陷的凹窝包裹，由内吞小体进入细胞，最后出现在溶酶体中，并没有出现在包被囊泡(Coated vesicles)中，也没有见到病毒直接穿过质膜的现象。与牛痘病毒(VV)不同，ASFV通过发动蛋白依赖和网格蛋白介导的内吞作用进入猪巨噬细胞，强烈依赖pH，Bernardes C等[17]发现清除胆固醇或用胆固醇氧化酶处理的Vero细胞在结合或内化病毒的能力上都没有改变，但ASFV的融合和随后的病毒复制却被阻断，因此，细胞膜中的胆固醇，而非脂筏或凹陷，是实现ASFV感染的必要条件。但是，Bruno Hernaez等[18]认为网格蛋白覆盖的凹窝成分Eps15为感染相关细胞因子，以及发动蛋白GTPase活性、肌动蛋白依赖的内吞作用和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)活性等都参与了病毒的侵入[19]。

2.2 大型胞饮 Elena G Sa'chez等[15]将光学显微镜和电子显微镜结合，发现适应于Vero细胞生长的ASFV强毒株Ba71和强毒株E70可以引起细胞质膜扰动，起泡和褶皱。病毒粒子内化依赖于肌动蛋白重新组合、Na+/H+交换器的活性等典型的大胞饮内吞机制的信号，而且病毒进入细胞似乎直接刺激右旋糖酐摄取、肌动蛋白极化和EGFR、PI3K-Akt、Pak1和Rac1的激活，而抑制这些重要的大胞饮调节因子，以及使用药物乙基异丙基氨氯吡咪(EIPA)治疗，可以显著减少ASFV的进入和感染[4]。但是，针对这观点Bruno Hernaez 等发现Na+/H+离子通道抑制剂和肌动蛋白聚合抑制没有显著改变ASFV感染，认为大胞饮并不是ASFV的主要进入途径[18]。

2.3 巨噬细胞内吞 Sameh Basta等[14]发现在病毒与细胞作用的过程中，二价阳离子依赖活性特别重要，这与内吞和内涵体处理所需的微管组装的病毒需求有关。肌动蛋白依赖的内吞作用和涉及微管活性的内吞流通也密切相关，因此，认为受体介导内吞作用不是病毒进入感染宿主细胞Mø的唯一方法，更像病毒是通过吞噬进入细胞的。Germán Andrés等[3]则认为ASFV通过巨噬细胞吞噬和网格蛋白介导的内吞两种途径进入巨噬细胞。

3 在内吞小体脱壳

ASFV感染的早期阶段，病毒内吞进入细胞后一小时内脱壳，首先涉及到外层衣壳层的脱落，随后是病毒内膜与内吞小体的融合[15]，其中，内吞小体的酸化对病毒的成功感染十分必要，逐步在低pH驱动下内吞小体分解[20]，再将裸的基因组核心释放到细胞质中。这一过程中由Rab蛋白和PIs协调的EE和LE隔间以及内吞小体成熟通路的完整性发挥了核心作用[21]。病毒蛋白pE248R是病毒颗粒的晚期结构成分，具有分子内二硫键，氨基酸序列包含一个推定的肉豆蔻酰化位点和靠近其羧基末端的疏水跨膜区域，pE248R在感染过程中被肉豆蔻酰化，并与被感染细胞的膜部分结合成为一个完整的膜蛋白。pE199L是一个富含半胱氨酸完整的跨膜多肽，也具有分子内二硫键。研究表明，pE199L和pE248R不是病毒组装、释放以及病毒与细胞结合和内吞所必需的，而是膜融合和病毒基因组进入细胞所必需的，缺少这两个基因的突变毒株，早期和晚期基因表达将受到损害，感染性大幅降低[22]。可以推断，ASFV基因组进入细胞依赖于由pE248R和pE199L组成的融合机制，病毒在细胞内脱壳过程，这两个蛋白发挥了与内吞小体的融合作用[23]。

4 病毒的生物合成

一旦ASFV脱壳脱离了内吞溶酶体复合体后，病毒就绕过成熟的溶酶体，包括自噬体-溶酶体传递，避免了被降解。然而，病毒的复制显然还要依赖于某些溶酶体功能，即对丙胺敏感的活性是病毒所必需的，而长春碱和亮肽酶素敏感的功能仅部分影响病毒的复制[14]。而且，病毒需要通过内溶酶体、微管细胞骨架运输系统转运到生物合成的场所，已知的病毒编码酶的合成、蛋白质合成都发生在细胞质的不同位置，而病毒基因组复制在细胞核内开始，而大部分的复制和组装主要发生在细胞核周离散区域，即病毒工厂。在相关生物合成因子的研究方面，通过绿色荧光蛋白融合和MYC标记蛋白的重叠试验结果表明，ASFV p37和p14蛋白具有核质转运活性[24]。p14蛋白的作用是输入到细胞核，p37蛋白在感染的早期阶段存在于细胞核的局部，后期只在细胞质中[25]，参与病毒DNA在细胞核内外的转运[26]。待病毒基因组和蛋白质合成后组装成子代病毒粒子，沿着微管被运送到质膜，在那里它们通过出芽或由肌动蛋白推动离开被感染的细胞，病毒的进入和退出，都依赖于细胞骨架的各种成分[6]。与此同时，ASFV通过细胞内的通路诱导了感染细胞的凋亡[27]。

5 展 望

病毒进入细胞的途径和方式决定了病毒的趋向性和发病机制。ASFV作为一种重要的动物传染病原体，对其入侵的阻断是预防和治疗非洲猪瘟的重要研究目标，对ASFV与宿主细胞相互作用的研究，可深入揭示病毒致病和机体免疫的机制，为开发针对该病毒的新预防策略提供研究思路。但是，目前对ASFV入侵机制的了解仍然非常有限，特别是关于细胞受体、病毒穿入细胞的方式仍处于争议之中，普遍认为ASFV通过多种方式穿入细胞。同时，病毒与天然宿主巨噬细胞和适应性Vero细胞的相互作用可能存在一定的区别。因此，进一步揭示ASFV的宿主细胞受体、穿入细胞的方式以及脱壳机制的研究仍然是未来的研究方向，也具有十分重要的现实意义。