清呼合剂急性毒性试验研究

景慕娴，谢晓莉，李连缺，张一丽，米国华，刘 明，赵 达

(1.石家庄江山动物药业有限公司，石家庄050200；2.河北工程技术学院，石家庄 050000；3.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；4.石家庄市藁城区畜牧工作总站，石家庄 050000；5.河北省口服兽药制剂创新技术中心，石家庄050200)

清呼合剂为本文研究的新兽药复方制剂，由黄芩、枇杷叶等6味中药组成，具有清肺化痰、止咳平喘之功效，主治由风热犯肺或风寒郁而化热等各种原因引起的肺热咳喘证。为客观评价该制剂的安全性，依据农业部兽药评审中心《兽药研究技术指导原则汇编(2006-2011)》[1]，通过对KM小鼠单次灌胃清呼合剂，连续观察试验小鼠出现的中毒症状、中毒程度、性质及死亡情况，评价受试药物毒性作用的性质，毒效应的特征及可能的靶器官，初步判断受试药物的危险性，并探求受试药物的剂量-效应关系，求出半数致死量LD50及95%可信限，为评价其安全性提供依据[2-4]。

1 材料与方法

1.1 受试药物 清呼合剂，250 mL/瓶，每1 mL相当于原生药1 g，批号20180327，由石家庄江山动物药业有限公司生产。试验时取本品加入蒸馏水，按最大剂量组配制供试品溶液，其他浓度按等容量稀释法(1:K稀释)进行稀释。

1.2 实验动物 SPF级健康KM小鼠，体重18 g～22 g，72只(其中12只用于首次实验)，雌雄各半，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2019-0008。将KM小鼠隔离检疫5～7 d，在检疫期间动物摄食、饮水和健康状态良好。皮毛光滑、反应灵敏，粪便成形，眼、耳、鼻及会阴处无分泌物，动物确认健康无病后可用于试验。

1.3 试验动物分组及给药剂量 选取SPF小鼠12只(雌、雄各半)进行首次试验，设3个剂量组，每组4只(雌、雄各半)。试验前禁食不禁水12 h，分别灌服清呼合剂1次，灌胃体积为0.2 mL/10 g体重，具体剂量见表1。如果高剂量组(剂量为5000 mg/kg)死亡率为0%，则进行重复试验一、重复试验二[5-7]，即分别选取30只小鼠(雌、雄各半)，各设3个剂量组，每组10只(雌、雄各半)，灌服清呼合剂1次，灌胃体积为0.2 mL/10 g体重，具体剂量见表2和表3。

表1 清呼合剂KM小鼠急性毒性试验首次试验-剂量及分组

表2 清呼合剂KM小鼠急性毒性试验重复试验一-剂量及分组

表3 清呼合剂KM小鼠急性毒性试验重复试验二-剂量及分组

1.4 试验观察 给药4 h严密观察动物对供试品的反应，以后每天观察一次，连续观察7 d，4 d如有动物死亡则观察14 d。观察内容：动物外观、活动情况、呼吸状态、粪便形态、营养状况、被毛光泽[1,8]。对动物毒性反应情况、中毒症状、严重程度、中毒发生时间、持续时间、恢复时间、动物死亡时间及死亡数量进行详细记录，对死亡动物进行大体解剖。

1.5 结果统计 统计并分析清呼合剂各剂量组的动物死亡数。

1.6 毒性分级评定 依据半数致死量(LD50)及急性毒性(LD50)剂量分级表[1]，对受试药物的毒性进行分级。见表4。

表4 急性毒性(LD50)剂量分级表

2 结果与分析

2.1 首次试验结果 首次试验中，清呼合剂各剂量组实验小鼠灌胃给药后，4 h内小鼠均未出现异常现象，连续观察小鼠7 d后，各组小鼠行为及精神状态良好(临床表现如2.2图1所示)，眼、鼻、口腔及肛门均无分泌物，二便正常，且各组小鼠均未出现死亡。结果见表5、表6。

表5 急性毒性试验首次试验结果

表6 啮齿动物中毒表现及观察项目

2.2 重复试验结果 重复试验一和重复试验二中，清呼合剂各剂量组实验小鼠灌胃给药后，4 h内小鼠均未出现异常现象，连续观察小鼠7 d后，各组小鼠均未出现死亡(表7)，且小鼠行为及精神状态等均正常(图1)，观察结果同表6。各组小鼠均未出现死亡，即小鼠的死亡率为0。由此可见，清呼合剂对KM小鼠的LD50大于5000 mg/kg·bw。

表7 急性毒性试验重复试验结果

2.3 毒性分级评定 从本试验结果可知清呼合剂的LD50大于5000 mg/kg，按1.6表4急性毒性(LD50)剂量分级表进行分级，清呼合剂属于实际无毒类中兽药。

3 讨论与结论

兽药三个基本要素属性包括安全性、药品的质量可控性以及临床的有效性。兽药的优与劣，除取决于有效性，还取决于毒性的高低。因此，在新兽药的开发与研究中必须要进行安全性评价[9-10]。急性毒理试验是安全性评价的首要内容，指一日内对动物单次或多次给药，连续观察给药后动物产生的毒性反应及死亡情况的试验方法[11]，进而测定引起动物急性中毒的剂量，揭示动物在中毒过程中出现的毒性反应和靶器官[12]。常用LD50的测定来评价兽药急性毒性试验。

清呼合剂为纯中药复方新制剂，由黄芩、枇杷叶等6味中药组成，前期药效学试验表明，清呼合剂具有镇咳、祛痰、平喘、抗菌、抗炎等作用[13]。本试验依据《兽药研究技术指导原则汇编(2006-2011)》“兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则”，对清呼合剂进行了急性毒性评价试验。首次试验结果显示，KM小鼠口服高剂量已达5000 mg/kg的清呼合剂，未出现小鼠的死亡、精神及行为等异常。将小鼠增加至10只(雌雄各半)重复两次试验，结果仍未见死亡及中毒症状。因此，确定了清呼合剂对KM小鼠的LD50大于5000 mg/kg。根据急性毒性(LD50)剂量分级表进行分级判断，清呼合剂属于实际无毒类中兽药，这为评价其安全性提供了有力依据，同时为后续长期毒性试验的剂量使用提供依据。