miR-495的生物学功能及与肿瘤关系的研究进展〔1〕

黄灵娟，徐颢

(1.西安医学院第一附属医院，陕西 西安 710077；2.西安医学院第一附属医院全科医学院，陕西 西安 710077；3.西安市第三医院，陕西 西安 710077)

微小RNA(miRNA/miR)在人类各种类型的癌症中均有异常表达，即许多miRNA参与了肿瘤的发生和发展。基于miRNA及其可能调控的靶基因的治疗策略，显著提高了癌细胞对化疗药物的敏感性。然而，众多miRNA在恶性肿瘤中的作用及发病机制并不明确。人类基因组中14q32.31基因簇上包含许多编码miRNA的基因，miR-495就是其中之一。它与该基因簇上的miR-299-5p，miR-376a，miR-376c，miR-300，miR-380，miR-494，miR-1197等一样，具有相似的病理生理调节作用[1]。miR-495分别从pre-miRNA-495的茎环结构的3＇-和5＇-链剪切形成miR-495-3p和miR-495-5p，但miR-495在各种肿瘤中的表达情况不尽相同。本文对miR-495在机体正常发育、免疫和炎症中的作用及其在癌症中的调节功能作一综述。

1 miR-495的生物学功能

miRNA通过与其靶基因的3＇非翻译区不完全或完全互补结合，进而负性调控靶基因的表达，从而在正常生理和病理过程中发挥重要作用。Choi等[2]通过感染小鼠高毒性禽流感H5N2病毒，检测到有9个miRNA在小鼠体内被上调，其中包括miR-495。最后确定，这些miRNA参与了免疫相关反应、细胞凋亡和禽流感H5N2病毒的复制。miR-495也是人间充质软骨干细胞分化的重要调节因子，能诱导SRY相关高迁移率族盒基因9(SOX9)的高表达，最终有助于软骨形成分化[3]。同时，SOX9在软骨发育中的功能也依赖于miR-495。在炎症性疾病方面，miR-495与具有核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)基因突变的克隆恩病(CD)的发病机制密切相关。miR-495的过表达导致NOD2表达下降，进而抑制核转录因子(NF-κB)活性，并下调白细胞介素8(IL-8)和趋化因子配体3(CXCL3)信使RNA的表达。因此，学者认为，包括miR-495在内的miRNA可能成为有和无NOD2基因突变的CD患者的潜在抗炎治疗策略[4]。

2 miR-495与肿瘤

2.1 miR-495与胃癌

胃癌(GC)是最常见的消化系统肿瘤。大多数GC被诊断时已经发现有远处病灶的转移。Li等[5]在原发性GC组织中预测了靶向再生肝磷酸酶3(PRL-3)的两种miRNA，分别是miR-495和miR-551a，两者均在GC样本中表达下调。在转染miR-495和miR-551a模拟物的GC细胞系中，通过实时定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质印迹技术验证了这两种miRNA与PRL-3存在相互作用。转染miR-495或miR-551a模拟物后，可显著抑制GC细胞的迁移和侵袭。研究[5]表明miR-495和miR-551a充当肿瘤抑制因子的角色，通过靶向PRL-3癌基因抑制GC细胞迁移和侵袭，进而发挥抑癌作用。在GC腹膜转移和淋巴结转移(LNM)患者组织标本中，miR-495也显著下调。PRL-3被认为与GC的转移有关。PRL-3是miR-495的下游靶标，miR-495通过上调PRL-3促进GC细胞的运动、侵袭和转移，进而发挥致病作用。转染miR-495模拟物可抑制GC细胞的侵袭和转移。然而，miR-495通过上调靶基因PRL-3的表达而促进GC腹膜转移的分子调控机制仍有待阐明。有研究[6]采用甲基化特异性PCR和亚硫酸氢钠测序法检测miR-495启动子甲基化状态，发现用5-Aza-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理GC细胞系后，miR-495启动子甲基化失活，显著抑制GC细胞的迁移和侵袭能力；而miR-495过表达，PRL-3的mRNA和蛋白水平降低，侵袭转移能力减弱，提示miR-495具有抑癌特性。总之，在GC中miR-495的去甲基化处理，将为预防和治疗GC腹膜转移提供新的策略。

2.2 miR-495与血液系统恶性肿瘤

miRNA被认为是包括白血病在内的所有生物发育过程中的重要表达调节因子。Jiang等[7]通过对85 例人类急性髓系白血病(AML)和15 例正常对照样本的全基因组miRNA表达谱进行分析，发现在混合系白血病(MLL)和非MLL重排的AML样本中有48个显著差异表达的基因，但仅miR-495在MLL中的表达水平低于非MLL重排的AML。该研究表明，造血细胞中miR-495的产生存在MLL融合基因介导的负调控。人和小鼠正常造血干/祖细胞中MLL融合基因的异位表达可以显著下调miR-495的内源性表达，并且在体外证实miR-495能促进MLL融合基因介导的细胞转化和体内白血病的发生。骨髓嗜生态病毒整合位点1(MEIS1)和前B细胞白血病同源框转录因子3(PBX3)都是MLL融合蛋白的重要下游靶基因，在MLL重排白血病的发生和维持中发挥关键的致癌作用。研究[7]表明，PBX3和MEIS1是miR-495的两个直接靶基因，它们中任何一个的低表达都可以逆转miR-495过表达所致的细胞活力抑制。因此，miR-495可能作为肿瘤抑制因子在具有MLL重排的AML中发挥作用。此外，miR-495与化疗药物的耐药有关。据报道，许多位于14q32.31基因簇上的miRNA在抗阿霉素(ADM)耐药白血病细胞系(K562/ADM)中被下调。在K562/ADM细胞中转染miR-495模拟物可以下调P-糖蛋白表达，增加对ADM的敏感性。同时发现，miR-495还能增加慢性髓系白血病细胞(CML)的化疗敏感性[8]。因此，miRNA-495可能为肿瘤耐药治疗提供了新的可能途径。

2.3 miR-495与肺癌

miRNA可在转录及转录后调节肺癌致病基因的表达。已有研究[9]证实，miR-495作为抑癌基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中显著下调；miR-495与肺癌化疗药物耐药有关。转运铜的P型三磷酸腺苷A(ATP7A)与NSCLC中的铂类药物耐药性相关。Song等[10]研究小组企图通过靶向NSCLC中ATP7A探索哪些miRNA可能参与肺癌铂类耐药。通过基因芯片和生物信息学分析，筛选出miR-495作为候选miRNA。随后证实ATP7A是miR-495的直接靶标。药敏实验表明，miR-495增强了NSCLC细胞对顺铂的药效反应，而抑制miR-495则导致相反的效果。除此之外，miR-495能增加细胞内顺铂的积累，而ATP7A的过表达可以降低miR-495诱导的药物浓度增加，表明miR-495通过调节NSCLC中ATP7A的表达来调节多重耐药性。miR-495可作为治疗多重耐药NSCLC患者的可能策略[10]。

2.4 miR-495与胶质母细胞瘤

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵袭性的胶质瘤类型，预后差。因此，迫切需要了解胶质瘤发生的机制及治疗方法。一项临床研究[11]发现，在GBM患者中，miR-495呈显著低水平表达，而细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)被证实为高表达。CDK6的高表达与GBM患者低存活率相关。在GBM T98细胞中发现，miR-495的过表达下调了CDK6的表达。通过小干扰RNA(siRNA)敲低GBM U87-MG和T98细胞中的CDK6，导致细胞周期停滞在G1/S期，继而抑制细胞增殖。该研究证实了miR-495在胶质瘤组织中表达下调，表明miR-495在肿瘤进展中可能发挥作用，但需要进一步研究来确定miR-495通过降低CDK6表达来抑制胶质瘤细胞增殖的确切机制。

2.5 miR-495与前列腺癌

miRNA的异常表达也与前列腺癌(PCa)进展有关。越来越多的证据确定，miR-495在PCa的发生发展中扮演着抑癌基因的角色。与正常前列腺上皮细胞相比，PCa细胞系中的miR-495表达下降。此外，有研究[12]发现，扩增的miR-495在体外可抑制PCa细胞增殖、迁移和侵袭，并通过抑制AKT和雷帕霉素的靶标(mTOR)显著延缓体内肿瘤的生长。赖氨酸特异性脱甲基酶5A(KDM5A)作为一种去甲基化酶，可以与miR-495的启动子区域结合，抑制其转录，然后降低其在人PCa细胞中的表达，从而促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移，减少细胞凋亡。既然KDM5A可通过抑制miR-495而促进PCa的恶性进展，那么miR-495在PCa中的潜在作用机制是什么? Du等[13]通过生物信息学分析预测了miR-495和m6A阅读器蛋白YTH结构域家族成员2(YTHDF2)可能的结合位点，随后通过双荧光素酶报告基因等实验方法证实了miR-495可以靶向YTHDF2并抑制其在PCa细胞中的表达。YTHDF2的过表达可破坏miR-495对PCa细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用，进而实现对细胞凋亡的促进作用。为了进一步阐明KDM5A/miR-495/YTHDF2在PCa中的作用机制，研究者应用实时定量PCR技术检测了PCa组织中抑癌基因mps-结合激酶激活剂3B(MOB3B)mRNA和蛋白的表达情况，发现两者表达均下降，MOB3B的N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰水平也在降低；多样本分析认为KDM5A与MOB3B表达存在显著负相关。最后确定KDM5A可以通过抑制miR-495，上调YTHDF2的表达，下调MOB3B的表达，进而刺激PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。随后裸鼠成瘤试验也验证了这一假设[13]。以上结果说明，miR-495作为抑癌基因，在PCa的发生及进展中发挥着重要作用。

2.6 miR-495与乳腺癌

在大多数国家，乳腺癌(BC)是女性发病和死亡的主要原因，发病率呈逐年上升趋势。研究[14]发现，miRNA-495在许多癌细胞中具有抑癌作用。有研究[15]表明，高甲基化可能是miRNA-495表达抑制的主要原因。在BC细胞中，miR-495基因CpG岛的高甲基化导致miR-495沉默和STAT-3表达上调。DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC能够逆转DNA甲基化，导致miR-495表达上调，进而抑制癌细胞在BC中的生长和存活。该研究表明，去甲基化激活miR-495基因的表达可能是人类BC的一种新的联合疗法。除此之外，Alkhathami等[16]研究小组也在BC患者中观察到miR-495表达下降，且其低表达与轴突蛋白-1(NRXN-1)呈负相关，而NRXN-1和接触蛋白-1(CNTN-1)表达增加与BC疾病进展和远处转移有关。因此，miR-495可能是重要的预测乳腺癌患者疾病进展的标志物。

然而也有研究[17]发现，miR-495在乳腺癌干细胞(BCSCs)中高表达；上调的miR-495能维持BCSCs的表型，并通过抑制E-钙黏蛋白表达，促进上皮间质转化(EMT)，导致癌细胞侵袭。在BC临床标本中证实，miR-495可通过抑制连接黏附分子A(JAM-A)促进乳腺癌的进展。由此可见，miR-495在BC中也可能扮演着促癌基因的角色。与其他肿瘤一样，乳腺癌的发病机制也与缺氧相关[18-20]。研究[21]发现，miR-495通过靶向DNA损伤诱导转录本4(REDD1/DDIT4)基因，抑制其在缺氧时的诱导，从而导致组成性抗缺氧细胞增殖，产生抗肿瘤效应。体内实验也证实，miR-495在乳腺癌细胞中的异位表达促进了它们在体外的集落形成和小鼠肿瘤的发生。这些发现揭示了一种以miR-495为中心的新的调节途径，有助于理解BCSCs的特性和缺氧耐受性。

2.7 miR-495与肝癌

肝癌(HCC)是全球第五大常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大常见原因。研究[21]发现，miR-495在HCC中呈低表达。上调的miR-495通过降低HCC中甲硫氨酸腺苷转移酶1A(MAT1A)mRNA的表达促进肝癌细胞的增殖。在HCC小鼠模型中，miR-495的稳定过表达，下调了MAT1A，促进了HCC细胞的侵袭和转移。Zhang等[22]通过生物信息学预测肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)可能是miR-495的另一潜在靶标。CTRP3可通过转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激肿瘤细胞增殖和迁移。将HCC中低表达的miR-495过表达后，通过直接靶向CTRP3可抑制肝癌细胞的生长。体内实验表明miR-495可阻止小鼠HCC的进展。与阴性对照组相比，miR-495过表达组小鼠肿瘤体积更小。此外，在miR-495过表达组中观察到CTRP3表达水平降低三倍以上。体内研究结果与体外一致。该研究充分表明，miR-495有可能成为HCC治疗的潜在生物靶标，但局限性在于并未深入探讨miR-495靶向CTRP3的作用机制[22]。锌指蛋白503(ZNF503)在维持正常细胞组织发育和肿瘤发生过程中起关键的调节作用。Yin等[23]首次发现ZNF503在HCC组织和细胞中上调，miR-495与ZNF503表达呈负相关。并且证实了ZNF503通过负性调控miR-495的表达，进而调节GATA结合蛋白3(GATA3)启动子的表达，抑制HCC细胞迁移、侵袭和EMT的过程，这一研究成果表明miR-495间接参与了HCC的发生及发展[23]。Ye等[24]研究发现，miR-495在HCC组织和细胞系中表达下调，且miR-495的表达水平与HCC患者的肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移显著相关；功能测定显示miR-495过表达可抑制HCC中的细胞增殖和侵袭。胰岛素样生长因子受体-1(IGF1R)被确定为HCC中miR-495的直接靶基因。IGF1R在HCC组织中上调，与miR-495的表达水平呈负相关。IGF1R上调后可以抑制miR-495的表达，进而促使HCC的进展。相反，过表达miR-495后，IGF1R的表达下降，促进HCC细胞凋亡。研究发现，miR-495通过直接靶向IGF1R并调节AKT和ERK信号通路抑制HCC细胞的增殖和侵袭。这些结果为HCC进展的分子机制提供了新的见解，表明miR-495可作为HCC新的治疗靶点[24]。

尽管不少研究认为miR-495在HCC中低表达，但Wang等[25]收集56 例肝细胞癌组织标本(HCC组)和40 例正常肝组织标本(对照组)，通过逆转录实时荧光定量PCR技术检测发现，miR-495在肝癌组织中呈高表达，且后续临床资料分析发现，其与HCC患者临床病理特征有一定关系。miR-495 inhibitor处理肝癌MHCC-97H细胞后，其增殖以及迁移能力减弱。这一研究结果与以上miR-495在HCC中低表达的研究结论不符，可能与临床样本偏差及实验技术方法不同等有关。

2.8 miR-495与胆囊癌

一项关于胆囊癌(GBC)的研究发现，PH结构域和富含亮氨酸的重复蛋白磷酸酶(PHLPP)是miR-495的另一靶标[26]。PHLPP被认为是具有很强的细胞凋亡诱导作用。在GBC组织和细胞系中，PHLPP表达降低，miR-495表达升高，促进生存素基因survivin表达增加。PHLPP高表达后可以直接通过促进survivin的磷酸化，或间接通过蛋白激酶B/AKT丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路，促进GBC增殖。已经提出miR-495/PHLPP/AKT/survivin抗凋亡信号通路的存在。随后研究者在裸鼠GBC异种移植模型中发现，增加PHLPP表达或抑制miR-495表达可诱导细胞凋亡并抑制肿瘤生长，并提出了针对miR-495/PHLPP/AKT/survivin调控通路的基因治疗策略。

3 展 望

综上，miR-495在大多数恶性肿瘤中充当抑癌基因的角色，通过调节靶基因的表达，抑制癌细胞的增殖、凋亡及迁移。但在部分肿瘤中也扮演着癌基因的作用，促进肿瘤的发生及进展。miR-495在某些癌症细胞中上调或下调的原因仍不清楚。尽管一些研究已经明确了miR-495调节靶基因的作用机制，但众所周知，miRNA与靶基因是一对多或多对一的关系，一个特定的miRNA可以调控多种靶基因，不同靶基因又具有不同的调节作用。因此，miR-495的多靶点调控机制后续仍需进一步在更多的临床标本、细胞及动物模型中研究。同时，通过miRNA-495拮抗剂或miRNA模拟物纠正其在肿瘤中原本失调的表达可能是一种新的抗癌治疗策略。