BCG感染树突状细胞的转录组测序和分析

孙巧玲，袁 欣，王 玉

结核病是由结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性传染性疾病。根据2020年全球结核病报告显示，结核病是全球十大死亡原因之一[1]，而耐药结核病、艾滋病以及新冠肺炎的合并感染使得结核病更难防治[2]。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是重要的专职抗原提呈细胞，能够激活幼稚T细胞，诱导适应性免疫应答[3]。当MTB感染时，DC通过吞噬、抗原提呈、细胞因子分泌等功能[4]，参与宿主炎症反应和免疫应答[5]。

卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是牛结核分枝杆菌减毒活菌株[6]，是目前唯一公认的结核疫苗[7]。但BCG的免疫效果，尤其是对成人结核病的免疫保护效果并不理想[8-9]，这一原因可能与CD8+T细胞活性减弱和免疫记忆持续时间受限有关[10-11]。目前已有研究发现，BCG表面肽聚糖和阿拉伯半乳糖等病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)能与DC模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)结合，刺激DC活化和分泌细胞因子[8,12-15]。而BCG也能调控DC功能，如BCG Hip蛋白缺失可促进DC活化，进而增强小鼠肺内细胞免疫应答[16]。至今为止，BCG胞内免疫机制仍未完全阐明。

因此，本实验采用转录组测序技术，以小鼠树突状细胞(DC2.4)为模型，研究BCG感染的树突状细胞内基因表达变化，挖掘与BCG感染相关的基因，为深入解析BCG的固有免疫机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基以及胎牛血清购自美国Gibco公司；Tween-80购自重庆川江化学试剂厂；TRizol试剂、Middlebrook 7H9培养基以及OADC增菌液购自美国BD公司；反转录试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；定量PCR试剂盒购自美国APE x BIO公司；引物由中国上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 实验菌株及细胞 BCG以及DC2.4细胞均由本实验室提供。

1.3 方 法

1.3.1 BCG培养 将BCG接种于含有0.2%Tween-80和10% OADC增菌液的Middlebrook 7H9培养液中，置于37 ℃摇床培养3周，3 000 r/min离心10 min，PBS清洗2次后，用2 mL PBS重悬后，测定OD600，计算BCG浓度。

1.3.2 DC2.4培养以及BCG感染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养细胞，待细胞密度为80%左右时，对细胞进行消化、计数，以1×106个/mL密度接种于六孔板，次日更换新鲜培养基，加入BCG悬液(MOI=2)，3 h后换液，置于37 ℃孵箱培养24 h，以未感染的DC2.4细胞为对照组。

1.3.3 样本制备 1×PBS洗2次后，每孔加入1 mL TRizol试剂，收集样本，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3.4 转录组测序 用TRizol提取BCG感染DC2.4细胞24 h后的总RNA，将样本送至深圳华大基因生物科技有限公司进行测序和数据分析。基于DNBSEQ测序平台，将测序所得的原始数据(Raw data)经SOAPnuke软件对其进行过滤获得纯净序列(Clean reads)，然后用HISAT软件将得到的Clean reads比对到参考基因组序列，使用Bowtie2将Clean reads比对到参考基因序列。以“FDR≤0.05和|log2Fold Change|≥1”作为阈值来判断基因差异表达的显著性。并使用 R 的基础函数 phyper(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/Hypergeometric.html)计算 Pvalue。然后对 Pvalue 进行多重检验较正，校正软件包为 qvalue(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/qvalue.html)。最后以 Qvalue(corrected Pvalue)≤ 0.05 为阈值，满足此条件的GO term 定义为在候选基因中显著富集的 GO term；KEGG Pathway富集分析与GO功能富集分析方法相同。

1.4 qRT-PCR实验验证及分析 为验证转录组测序结果，随机挑选了5个与BCG感染树突状细胞相关的差异表达基因(Msr1、Ccl7、Cx3cr1、Cd86和Hmox1)并采用RT-qPCR实验验证。引物如表1。反应体系为10 L，其中包括2× SYBR Green qPCR Master Mix 5 L, Forward Primer 0.5 L, Reverse Primer 0.5 L，cDNA 1 L, 50×ROX Reference Dye 0.2 L, DEPC水2.8 L。反应程序为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s，共40个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。数据用2-ΔΔct法计算各个基因的相对表达量，以β-Actin为内参基因。实验设置3次重复。

表1 qRT-PCR引物列表Tab.1 Primer sequences for real time quantitative PCR

1.5 统计学分析 采用2-ΔΔct法计算基因的相对表达量；采用GraphPad Prism 8.0对数据进行作图。

2 结 果

2.1 测序数据质控分析 对未感染组和感染组的细胞样本进行RNA-Seq数据分析，共获得27 235万条读段(reads)，总长度约40.86 G碱基。未感染组和感染组的Q20均大于97%，Q30均大于92%(表2)，表明原始数据质量较高，可用于后续生物信息学分析。

表2 测序数据统计表Tab.2 Statistical table of sequencing data

2.2 差异表达基因分析 本实验采用韦恩图展示未感染组和感染组基因表达情况(图1)：未感染组表达14 817个基因，感染组有14 951个基因。其中两组共表达基因14 149个，可见BCG感染导致DC细胞基因表达发生了变化。再以FDR<0.05(FDR是对P-value的校正值)且差异倍数绝对值≥1(|Log2Fc|≥1)为条件进行筛选，由图2所示，BCG感染后DCs内共有27个差异基因，其中有26个基因表达上调，1个基因表达下调。

图1 BCG感染DC2.4后差异表达基因的韦恩图Fig.1 Differentially expressed gene VEEN map of DC2.4 cells infected with BCG

图2 BCG感染DC2.4后差异表达基因的火山图与散点图Fig.2 Differentially expressed gene volcano diagram and scatter plot of DC2.4 cells infected with BCG

2.3 差异表达基因功能注释和富集分析

2.3.1 差异表达基因GO功能注释和富集分析 对BCG感染DC差异表达基因进行GO富集分析，包括生物学过程(biological process)，细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3类。结果如图3，将GO富集分析结果以气泡图进行展示，气泡颜色和大小分别代表P值大小和差异表达基因数量(图4)。其中BCG感染DC差异表达基因主要富集在细胞过程、生物调节、代谢过程、对刺激的反应以及免疫系统过程等生物学过程；细胞组成富集结果表明差异基因主要分布在细胞器、细胞膜等细胞部位；分子功能的富集结果显示，差异基因主要通过影响结合、催化活性、分子功能以及分子功能调节等功能来发挥作用。GO富集分析发现差异基因主要参与免疫系统过程、炎症反应以及对细菌的应答等功能。表明BCG感染能诱导DC产生炎症反应和免疫应答。

图3 BCG感染DC2.4后差异表达基因GO功能分类图Fig.3 Differentially expressed gene GO function classification map of DC2.4 cells infected with BCG

图4 BCG感染DC2.4后差异表达基因GO富集图Fig.4 Differentially expressed gene GO enrichment map of DC2.4 cells infected with BCG

2.4 KEGG富集分析结果 对差异表达基因进行KEGG代谢通路富集分析，如图5，差异基因主要参与了细胞生长与死亡、细胞免疫等生物过程；调节了信号转导等环境信息处理过程。此外差异表达基因还主要参与了病毒、细菌感染性疾病、癌症等人类疾病；与免疫系统、内分泌系统、发育与再生等生物系统相关。差异基因的KEGG通路富集分析发现差异基因主要参与了TNF、细胞因子与细胞因子受体相互作用、IL-17等信号通路(图6)。

图5 BCG感染DC2.4后差异基因KEGG通路分类图Fig.5 Differentially expressed gene KEGG pathway classification map of DC2.4 cells infected with BCG

图6 BCG感染DC2.4后KEGG Pathway富集图Fig.6 Differentially expressed gene KEGG pathway enrichment map of DC2.4 cells infected with BCG

2.5 qRT-PCR实验验证 为了证实转录组数据(表3)的可靠性，采用qRT-PCR技术验证差异表达上调基因Ccl7、Hmox1，差异表达下调基因Cx3cr1、Msr1、和Cd86的表达情况。结果表明(图7)，5个基因表达趋势与转录组结果一致。其中，Msr1、Cd86和Hmox1基因表达相当，基因Ccl7和Cx3cr1的qRT-PCR检测结果分别是转录组数据的1.7和0.4倍。

表3 5个差异表达基因在转录组数据中的信息Tab.3 Information on five differentially expressed genes in RNA-Seq

图7 转录组测序结果的qRT-PCR验证Fig.7 Results of RNA-Seq verification by qRT-PCR

3 讨 论

DC是连接机体天然免疫和适应性免疫应答的桥梁细胞，在宿主抗感染免疫中起着非常重要的作用[5,17]。BCG感染时DC可通过吞噬、抗原呈递、细胞因子分泌等功能，调控宿主炎症反应和免疫应答过程[5]。此外，BCG除了能诱导DC活化[3]，还可抑制细胞凋亡，促进DC存活[18]。但BCG的胞内免疫机制仍未完全阐明。本研究对BCG感染DC进行转录组测序以及生物信息学分析，筛选出27个差异表达基因并通过生物信息学分析找到参与BCG感染的细胞信号通路，为深入揭示BCG的胞内免疫机制提供方向。qRT-PCR验证Msr1、Ccl7、Cx3cr1、Cd86和Hmox1基因的表达趋势与转录组测序结果一致。说明转录组能用于筛选差异基因。

巨噬细胞清道夫受体1(Macrophage scavenger receptor 1，Msr1)属于A类清道夫受体[19]，作为模式识别受体参与了宿主炎症反应和免疫应答。有研究发现，Msr1能促进单核细胞增生性李斯特菌的内化作用[20]；在BCG以及MTB感染的巨噬细胞中，Msr1的表达增加[21]；而在本研究中，Msr1表达下降。据此推测Msr1在DC与巨噬细胞中的作用可能不同；此外，血红素加氧酶-1(Heme oxygenase 1,Hmox-1)和Cd86等基因也与免疫细胞吞噬、活化功能相关。Hmox-1在未成熟的DC中高表达，可限制其促炎作用[22-23]。而卡诺醇和姜黄素能上调Hmox-1来诱导DC成熟[24]。结合本研究中BCG感染导致Hmox-1表达上调，推测BCG可诱导DC活化。当Toll受体(TLRs)激活时，Cd86表达增加，DC活化[25]。而本研究中Cd86基因表达下调，这些矛盾的结果提示BCG可能并不能很好地激活DC；这可能也与BCG的免疫保护效果会随着时间的推移而减弱有关[26]。

趋化因子7(C-C motifchemokine 7，CCL7)和趋化因子受体1(CX3C chemokine receptor 1,Cx3cr1)基因与免疫细胞迁移和趋化相关。通常情况下，CCL7基因缺失或阻断会减少固有免疫细胞的招募，限制炎症反应，使机体更易被感染[27]；相反地，肿瘤中CCL7过表达会招募更多的DC,限制肿瘤的生长[28-29]。分泌高水平小鼠单核细胞趋化蛋白3的牛分枝杆菌BCG(即BCG MCP-3)接种小鼠后，导致更多的淋巴细胞迁移，增强T细胞免疫应答[29]。本研究进一步证实BCG可诱导DC产生CCL7，进而促进淋巴细胞迁移，激活适应性免疫应答。与CCL7不同，Cx3cr1主要与CSF-1R+髓系前体细胞向巨噬细胞/树突状细胞谱系分化有关[30]。本研究中Cx3cr1基因下调，提示BCG可能通过影响DC的分化来调控DC的免疫功能。由此可知，BCG感染调节了DC的活化、分化和迁移功能，进而影响T细胞免疫应答。

另外，在本研究中，以“FDR≤0.05和|log2Fold Change|≥1”为条件只筛选出27个差异表达基因，这可能与BCG不能很好地刺激DC细胞活化，从而影响DC细胞的抗原提呈功能有关。

综上，本研究通过转录组测序技术和生物信息学分析研究了BCG感染DC中基因表达的变化，并通过qRT-PCR证实转录组测序结果的可靠性，为深入探讨BCG的胞内免疫机制提供依据。

利益冲突：无