高效液相色谱法同时测定盐酸拉贝洛尔片中的3 种杂质

郝丽娟，徐艳梅，乔晓宁，闫凯，盖成，高燕霞

(河北省药品医疗器械检验研究院，国家药品监督管理局仿制药质量控制与评价重点实验室，石家庄 050227)

盐酸拉贝洛尔为国家基本药物，别名为柳胺苄心定，具有α和β受体双重阻滞活性，适用于各型高血压，特别是妊娠高血压[1-2]。盐酸拉贝洛尔分子中含有酚羟基和酰胺基结构，易被氧化和水解，在生产和贮藏过程中亦可能产生降解物，因其作为治疗妊娠高血压的重要药物，对安全性有着更加严格的要求，故有关物质的测定非常必要。盐酸拉贝洛尔片的现行质量标准和美国药典(USP)、日本药典(JP)均未设置有关物质检查项[3-5]；英国药典(BP)2020年版中，有关物质的测定采用薄层色谱(TLC)法[6]，分离度和准确度均较差。高效液相色谱(HPLC)法测定盐酸拉贝洛尔原料和注射液的含量和有关物质的文献报道中，只对单一杂质和总杂质进行了控制，均未测定已知杂质2-羟基-5-[1-羟基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸(杂质A)、2-羟基-5-[1-羟基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸甲酯(杂质B)和2-羟基-5-(2-(4-苯基丁-2-氨基)乙酰)苯甲酰胺(杂质F)[7-8]，另外未见对盐酸拉贝洛尔片进行有关物质检测的文献报道。为有效提高药物的安全性，笔者在系统考察盐酸拉贝洛尔的工艺杂质、合成中间体和降解产物的基础上，参照相关研究资料[6-10，12-15]针对杂质A、杂质B 和杂质F，建立了灵敏度高、专属性好的HPLC 法，文献中的HPLC 等度洗脱法未实现已知杂质的分离，笔者采用HPLC 梯度洗脱法，对各杂质实现了有效分离和同时准确定量，并且具有更低的检测限，简单快速，专属性好，为有效控制盐酸拉贝洛尔片的质量提供了一种新方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-20AT 型，日本岛津公司。

电子天平：XS105 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

盐酸拉贝洛尔对照品：质量分数为99.8%，批号为1744-096A1，美国TLC 公司。

杂质A 对照品：质量分数为98.1%，批号为2228-052A3，美国TLC 公司。

杂质B 对照品：质量分数为99.6%，批号为2148-016A3，美国TLC 公司。

杂质F对照品：质量分数为100%，批号为008-190403，A 药厂。

盐酸拉贝洛尔片：(1)批号分别为08181102、08181202、08181201，A 药 厂；(2) 批 号 分 别 为180202、180802、180901，B 药厂。

乙腈：色谱纯，德国默克EMD Millipore 公司。

磷酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

磷酸溶液：体积分数为0.1%，1 mL 磷酸加水至1 000 mL。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

混合杂质对照品储备液：3 种杂质的质量浓度均为0.125 g/L。精密称取杂质A、B、F 对照品各约12.5 mg，置于同一100 mL 容量瓶中，用磷酸溶液溶解并稀释至标线，摇匀，作为混合杂质对照品储备溶液。临用前，取混合杂质对照品储备液1 mL，置于25 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀释至标线，配制成3种杂质质量浓度均为0.05 g/L 的混合杂质对照品溶液。

样品溶液：盐酸拉贝洛尔质量浓度为2 mg/mL。取盐酸拉贝洛尔片20 片，研细混匀，精密称取细粉适量(约相当于盐酸拉贝洛尔50 mg)，用磷酸溶液溶解并稀释，定容于25 mL 容量瓶中，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

灵敏度测试溶液：精密量取样品溶液l mL，置于200 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀释至标线，摇匀，再精密量取l mL，置于20 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀释至标线，摇匀。

空白辅料溶液：模拟厂家处方，称取空白辅料适量用磷酸溶液溶解配制相应浓度的溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：磷酸溶液为流动相A，乙腈-磷酸溶液(体积比为50∶50)为流动相B，流量为1.5 mL/min；磷酸溶液初始比例为100%，5～40 min 由100%逐渐减小到0%，40～45 min 由0%逐渐增加到100%；检测波长：230 nm；柱温：40 ℃；进样体积：20 μL。

1.4 实验方法

取混合杂质对照品溶液、样品溶液、空白辅料溶液和灵敏度测试溶液按1.3 色谱条件检测，以外标法计算各杂质的含量。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 溶剂的选择

盐酸拉贝洛尔有两个手性碳原子，以一对非对映异构体的形式存在，有文献报道采用液相色谱-串联质谱法、毛细管电泳-质谱法和毛细管电泳法对盐酸拉贝洛尔非对映异构体分离和测定[9-11]。BP2020 年版[5]亦采用衍生化气相色谱法对非对映异构体的比例进行了控制。试验发现将盐酸拉贝洛尔分别溶解在水、质量分数为0.1%的磷酸溶液时，盐酸拉贝洛尔的一对非对映异构体合并为单个色谱峰出峰，分别溶解在乙醇和甲醇时，盐酸拉贝洛尔的一对非对映异构体分离成两个色谱峰，且两峰面积之和与溶剂为水时峰面积相当，DAD 检测器检测结果显示，两峰均归属于盐酸拉贝洛尔。笔者选择溶剂为0.1%磷酸溶液，以单个色谱峰进行考察。

2.1.2 检测波长的选择

分别配制质量浓度均为50 μg/mL 的盐酸拉贝洛尔、杂质A、杂质B 和杂质F 的单一对照品溶液，在200～900 nm 进行光谱扫描发现，盐酸拉贝洛尔和杂质A、杂质B 和杂质F 的最大吸收均在230 nm附近，故选择检测波长为230 nm。

2.2 色谱图

分别取混合杂质对照品溶液、空白辅料溶液、加标样品溶液按照1.3 色谱条件检测，色谱图见图1～图3。

图1 混合杂质对照品溶液色谱图

图2 空白辅料溶液色谱图

图3 加标样品溶液色谱图

由图1～图3 可知，各杂质与主峰均可以实现有效分离，空白辅料对检测结果无干扰，表明该方法专属性良好，可准确测定盐酸拉贝洛尔片中杂质的含量。

2.3 破坏及干扰试验

按表1 中的试验方法制备破坏性试验溶液，按照1.3 色谱条件检测，考察酸、碱、氧化、高温、光照破坏后，各杂质含量的变化情况，色谱图如图4～图8。结果表明，强降解条件下，杂质F 含量均未增加，推测杂质F 为工艺杂质，杂质A 在酸、碱、氧化、高温、光照破坏后均增加，杂质B 在碱、氧化、高温、光照破坏后均增加，提示应严格控制样品储藏和运输条件，减少降解杂质的产生。强降解条件下未产生其它干扰性杂质。

表1 破坏实验方法及结果

图4 酸破坏下的样品溶液色谱图

图5 碱破坏下的样品溶液色谱图

图6 氧化破坏下的样品溶液色谱图

图7 热破坏下的样品溶液色谱图

图8 光照破坏下的样品溶液色谱图

2.4 线性关系、检出限和定量限

分别精密量取混合杂质对照品溶液0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，用磷酸溶液稀释至标线，得系列标准工作溶液。以各杂质对照品质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。

将杂质对照品溶液进行适当稀释后制得一系列不同浓度的溶液，以信噪比3 对应的质量浓度作为检出限，信噪比10 对应的质量浓度作为定量限。

3 种杂质线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限结果见表2。

表2 3 种杂质线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 精密度试验

取盐酸拉贝洛尔片20 片，研细混匀，精密称取细粉适量(约相当于盐酸拉贝洛尔50 mg)，加入磷酸溶液溶解，移至25 mL 容量瓶中，精密加入混合杂质对照品溶液1 mL，用磷酸溶液稀释至标线。平行制备6 份，按1.3 色谱条件测定，结果列于表3。由表3 可知，3 种杂质测定值的相对标准偏差均小于2.0%，表明该方法具有良好的精密度。

表3 精密度试验结果

2.6 加标回收试验

取盐酸拉贝洛尔片细粉，精密称取3 份(约相当与盐酸拉贝洛尔50 mg)，置于25 mL 容量瓶中，分别加入磷酸溶液10 mL 溶解，再分别加入混合杂质对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，用磷酸溶液稀释至标线，摇匀。按1.3 色谱条件测定，计算加标回收率，结果见表4。由表4 可知，杂质A、杂质B、杂质C的平均回收率分别为98.0%、98.9%、98.0%，表明该法具有较高的准确度，可准确地测定盐酸拉贝洛尔片中的杂质含量。

表4 加标回收试验结果

2.7 稳定性试验

取盐酸拉贝洛尔片20 片，研细混匀，精密称取细粉适量(约相当于盐酸拉贝洛尔50 mg)，加入磷酸溶液溶解，精密加入混合对照品溶液1 mL，分别于室温下放置0、1、2、4、6、8 h，按1.3 色谱条件进样测定，考察不同时间下各杂质的含量，结果表明各杂质含量无明显变化，测定值的相对标准偏差均小于1.5%，表明样品溶液在室温下放置8 h 内稳定性良好。

2.8 耐用性

取杂质混合对照品溶液，对本方法进行耐用性的考察。在±0.2 mL/min 范围内变换流动相流量，在±5 ℃范围内改变初始柱温，在±5%范围内改变流动相A 即磷酸溶液的体积分数，以及采用不同色谱柱(AgelaVenusil MP C18柱(250 mm×4.6 mm，5µm) 和Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)进行测定，精密量取空白溶液、杂质混合对照品溶液和样品溶液，分别注入液相色谱仪，分析并记录色谱图。以标准曲线法计算盐酸拉贝洛尔片中的有关物质含量。结果显示，在较小范围改变测定条件，各杂质峰含量变化不大，表明该方法具有较好的耐用性。

3 结语

建立了高效液相色谱方法同时测定盐酸拉贝洛尔片中的杂质A、杂质B、杂质F，该方法具有较好的重复性，操作简单。该方法不受溶剂等因素影响，简便快速，可用于更好地控制盐酸拉贝洛尔片的质量。