高效液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿化妆品中禁用酮类香料

邱丰艳，韩飞，沈洁，戴尽波，洪燕萍

(1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012； 2.汕头职业技术学院自然科学系，广东汕头 515041；3.梅州市食品药品监督检验所，广东梅州 514015)

随着社会经济的发展，人们消费水平的提高，化妆品逐渐成为不可或缺的生活必需品[1-3]，消费群体涵盖从婴幼儿到老人各个年龄段。儿童皮肤娇嫩、抵抗力弱，易受伤害，随着育儿观念的转变，越来越多家长选择婴幼儿专属化妆品。化妆品由多种成分调配而成，各种化学成分的添加可能引入各类残留污染[4-6]。国家食品药品监督管理总局2015 年发布的《化妆品安全技术规范》中明确规定了1 388 种化妆品禁用组分[7-8]。由于化妆品原材料多样，产品成分各异，《化妆品安全技术规范》中规定禁用物质中仍然有一部分缺少相关检测方法，是化妆品中不可忽视的质量安全风险源[9-10]。

含酮基或芳香基团的化合物因具有特殊香气而常用作化妆品的香料成分或增香剂，但同时也是常见的过敏原[11-13]。除了欧盟化妆品法规(EC1223-2009-EU)中规定超过特定使用量必须在化妆品标签中标注的柠檬醛和香豆素等26 种致敏原外，化妆品原料中仍存在许多易致消费者过敏的香料成分，比如1-(4-甲氧苯基)-1-戊烯-3-酮、5-甲基-2，3-己二酮、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、2-羟基苯并咪唑和反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮[14-17]。由于这类化合物对消费者具有较明显的毒性和危害，在《化妆品安全技术规范》中明确标注为禁用成分，但缺乏相关检测方法，有必要开展检测方法研究。

由于化妆品形态多样，包括固体、液体、乳状、膏状等，各类样品基体不同，成分复杂，且基质干扰多，若采用液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)，可根据待测物分子结构、化学式等信息获得其精确相对分子质量，在高达上万的质谱分辨能力(FWHM)下，可利用精确相对分子质量作为待测物的确证信息而完成定性[18-21]。笔者采用LC-MS/MS法，围绕婴幼儿洗发液、沐浴液、爽身粉、润肤乳、牙膏等化妆品中5 种禁用酮类组分，建立该类组分的定性确证和定量测定方法，该法可有效去除基质干扰，适用于婴幼儿化妆品中酮类香料的分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：TRIPLE QUAD 3500型，美国AB SCIEX 公司。

分析天平：CPA324S 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯集团。

超纯水系统：Milli-Q 型，美国密理博公司。

氮吹仪：BYDCY-12Y 型，上海秉越电子仪器有限公司。

1-(4- 甲 氧 苯 基)-1- 戊 烯-3- 酮(CAS：104-27-8，缩 写MPO)、5- 甲 基-2，3- 己 二 酮(CAS：13706-86-0，缩 写ALO)、1- 乙 烯 基-2- 吡 咯 烷 酮(CAS：88-12-0，缩写VPO)、2-羟基苯并咪唑(CAS：615-16-7，缩写BDO)和反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮(CAS：122-57-6，缩写PBO)标准物质：纯度(质量分数)均不小于99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

氩气、氮气：纯度均大于99.999%。

乙腈、乙醇、元乙酸乙酯：均为色谱纯，美国默克公司。

1.2 溶液配制

分别准确称取5 种禁用酮类香料标准品10.0 mg(精确至0.1 mg)，用5%甲醇溶液溶解并定容至100 mL，分别制备成质量浓度为100.0 μg/mL 的单标储备溶液，于4 ℃避光保存。不同浓度的混合标准溶液及系列混合标准工作溶液由单标储备溶液混合，以5%甲醇溶液稀释制得。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱

色 谱 柱：SHIMADZU GIST-HP C18柱(100 mm×2.1 mm，3 µm)；柱温：35 ℃；流动相流量：0.4 mL/min；进样体积：5 μL；流动相：A 为0.1%(质量分数，下同)的甲酸水溶液，B 为甲醇，梯度洗脱，0～4.0 min 为5% B，4.0～4.5 min 为5%～95%B，4.5～5.5 min 为95%～98% B，5.5～8.0 min 为98%～100% B，8.0～12.0 min 为100%～5 % B。

1.3.2 质谱

电喷雾离子化正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)扫描模式；离子源配喷雾电压：5 000 V；离子化温度：500 ℃；射入电压：10 V；碰撞室射出电压：9 V；碰撞气：氩气，压力为55 kPa；气帘气、雾化气、加热辅助气：均为氮气，压力分别为138、138、138 kPa；其它相关参数见表1。

表1 5 种禁用酮类香料的MRM 离子对和保留时间

1.4 样品处理

称取1 g 均匀婴幼儿化妆品，加入10 mL 乙腈和5 g NaCl 后涡旋混匀，然后超声提取10 min(功率为600 W)，以8 000 r/min 离心5 min，取上清液于10 mL 试管中，于35 ℃下以氮气吹至近干，用1.0 mL 体积分数为5%的甲醇溶液溶解残渣，经0.22 μm 有机滤膜过滤，供LC-MS/MS 分析。

1.5 实验方法

分别取空白溶液、5 种禁用酮类香料系列混合标准溶液和样品溶液，按照1.3 仪器工作条件，分别导入LC-MS/MS 仪进行测定。利用色谱工作站软件MultiQuant ™分析、处理数据，以禁用酮类化合物的质量浓度为横坐标、特征离子的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品溶液中各个禁用酮类香料的含量。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

取各组分质量浓度均为0.1 μg/mL 的5 种酮类香料的混合标准溶液，经蠕动泵以10 μL/min 流量注入ESI 源进行质谱分析。通过Q1 全扫模式获得分子离子峰，用子离子模式对分子离子峰进行分析，从打碎的离子中选取两个特征离子作为定性和定量离子。用MRM 扫描模式优化去簇电压、碰撞能量、入口电压和碰撞室出口电压，使得定量与定性离子强度响应最大，优化后的5 种禁用酮类质谱参数见表1，总离子流色谱图及MRM 色谱图见图1～图6。

图1 5 种禁用酮类香料混合标准溶液总离子流图

图2 1-乙烯基-2-吡咯烷酮MRM 色谱图

图3 5-甲基-2，3-己二酮MRM 色谱图

图4 2-羟基苯并咪唑MRM 色谱图

图5 反式-4-苯基-3-丁烯-2-酮MRM 色谱图

图6 1-(4-甲氧苯基)-1-戊烯-3-酮MRM 色谱图

2.2 色谱条件的优化

比较了不同类型色谱柱(BEH-amide 色谱柱、C8色谱柱、F5色谱柱、HP-C18、T3 色谱柱)和流动相(乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol 乙酸铵溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和0.2%氨水溶液)对5 种禁用酮类香料的色谱分离效果。试验结果表明：当使用HP-C18色谱柱作为分析柱时，以甲醇-0.01%甲酸水溶液作为流动相时，5 种禁用酮类香料获得了良好的分离效果，峰形尖锐且对称，保留时间适中；在其它色谱柱或流动相中，部分目标化合物出现分离效果较差，响应值低，色谱峰拖尾或出现分叉峰；甲酸的加入可有效调节酮类化合物解离，改善峰形，增强正离子模式电离效率，因此实验选择以HP-C18色谱柱作为分析柱，甲醇-0.01%甲酸水溶液作为流动相。

2.3 样品处理条件优化

化妆品的基质较为复杂，因此需要选择合适的提取溶剂。选取3 种不同的提取溶剂(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)和不同的超声时间(5、10、15、20、25 min)考察对应的5 种禁用酮类香料的提取率，结果见图7。

图7 不同溶剂对应的5 种禁用酮类的提取率

试验结果表明：在相同的超声时间下，以甲醇为提取溶剂时，甲醇和水相无法分层，溶液较为浑浊，后续过滤分离较为困难；以乙腈和乙酸乙酯为提取溶剂时，在加入氯化钠的情况下，乙腈和乙酸乙酯均能与水相分层，5 种禁用酮类化合物的提取率为81.3%～98.4%；由于乙酸乙酯和正己烷互溶，因此无法通过加入正己烷以进一步除去杂质，而在乙腈中加入正己烷后，对5 种禁用酮类化合物的提取率无显著影响。因此选取乙腈为提取溶剂，在该条件下，考察了超声时间对回收率的影响，发现随着超声时间的增加，提取率增大，当超过10 min 后，提取率增大不明显，因此选择超声时间为10 min。

2.4 基质干扰的影响

为避免不同婴幼儿化妆品基质对5 种禁用酮类香料检测的干扰，在纯乙腈和空白婴幼儿化妆品中采用标准加入法，按照式(1)计算并评价婴幼儿化妆品中5 种禁用酮类香料的基质效应Me：

式中：A——纯乙腈中目标物的质谱响应强度；

B——空白婴幼儿化妆品中目标物的质谱响应强度。

当B＜A时，为基质减弱效应；当Me＜10%时，表明为不存在基质干扰现象；当20%＞Me ＞10%时，表明为低程度基质干扰现象；当50%＞Me ＞20%时，表明为中程度基质干扰；当Me ＞50%时，表明为高程度基质干扰。

采用标准加入法在纯乙腈和空白婴幼儿化妆品两种不同基质中分别加入0.1、0.5、1.0 μg/kg三种浓度的5 种禁用酮类香料标准物质，用所建LC-MS/MS 法测定5 种禁用酮类香料的基质效应Me 值，结果见表2。由表2 可知，基质效应Me 为3.1%～7.2%，说明不存在基质干扰现象。

表2 5 种禁用酮类香料的基质效应Me 测定值

2.5 线性方程、线性范围和方法检出限

配制各组分质量浓度均分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的系列混合标准溶液，按1.3 仪器工作条件分析，以质量浓度(x)为横坐标、特征离子的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，并对测定结果进行线性相关分析。

按照国际纯粹与应用化学联合会的规定，对空白溶液连续测定20 次，计算标准偏差，分别以3 倍和10 倍的标准差除以标准曲线斜率计算检出限和定量限。

5 种禁用酮类化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限列于表3。由表3 可知，5 种禁用酮类化合物质量浓度在0.5～50.0 μg/mL 范围内线性关系良好，相关系数r≥0.998；检 出 限 为0.03～0.15 μg/kg，定 量 限 为0.1～0.5 μg/kg，可用于婴幼儿护肤品中5 种禁用酮类香料的痕量检测。

表3 5 种禁用酮类化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 加标回收试验

在婴幼儿化妆品样品(洗发水、沐浴液、润肤乳)中依次添加5 种禁用酮类香料化合物标准溶液，使其最终质量浓度分别为0.1、0.5、1.0 μg/mL，在上述优化条件下进行测定，每个加标水平平行测定6次，结果见表4，加标婴幼儿润肤乳样品总离子流色谱图见图8。

图8 加标婴幼儿润肤乳样品总离子流色谱图

表4 加标回收与精密度试验结果(n=6)

由表4 可知，5 种禁用酮类香料化合物的加标回收率为84.3%～100.6%，测定结果的相对标准偏差为1.3%～3.8%(n=6)，表明该方法精密度和准确度均较高。

3 结语

以5 种禁用酮类香料化合物为研究对象，采用乙腈萃取婴幼儿化妆品，经超声萃取，氮吹浓缩，建立了婴幼儿化妆品中5 种禁用酮类香料的液相色谱-串联质谱快速筛查方法。该法具有回收率高、检出限低、精密度好等优点，可为进一步补充和完善婴幼儿化妆品中禁用酮类物质的卫生规范和质量监管提供技术支持。