超高压射流处理对大肠杆菌和沙门氏菌的影响

张歆

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

超高压射流是一种新型的非热杀菌技术，在液体食品中起到良好的杀菌作用。传统的灭菌技术简单而可控，虽然在食品加工领域的应用越来越多[1]，但对食品的感官质量和营养成分受到很大损害，无法达到现代食品最小化加工的需要[2]。

超高压射流是借助往复式高压泵将普通的水流增压，使其到达数百大气压之后，再从定制的高压喷嘴中发射出来，形成高速水射流，具有很强的穿透性[3]。过该技术处理的食品，由于所含的微生物蛋白质等受到压力凝固，酶失去活性和功能，细胞膜发生泄漏[4]，达到杀菌的效果，从而保证产品的安全性和较好的品质[5]。高压射流的灭菌方法属于动态灭菌法，和静态超高压相比具有处理量大，能保证食品的安全性，避免由高温杀菌引起的产品变质等优点[6]，液体食品的规模化杀菌方面具有良好运用前景。

大肠杆菌和沙门氏菌是食品中常见的污染微生物，国内外每年都会发生大肠杆菌和沙门氏菌食物中毒事件，带来巨大的经济损失。细菌性的食物中毒所占比例达70%是由沙门氏菌引起的[7]，研究显示，大肠杆菌、毒素和猪霍乱沙门氏菌是导致小猪仔腹泻的主要致病菌[8]，因此，对于这两种致病菌进行研究对公共卫生和食品安全具有重要意义[9]。

Lee等[10]对超高压结合热处理对苹果汁中酸土芽孢杆菌的影响进行了研究，结果表明在207 MPa压力下，45 ℃处理10 min或在71 ℃处理1 min就能够将活的孢子数量降低3.5个对数级。当微波功率为20 W，处理时间大于12.5 min时，沙门氏菌的数量下降了9.22 logCFU/mL，而在比20 W高的其他功率和处理时间1.5～2 min条件下，显示了极低的微生物存活，这是Portela等人[11]在对沙门氏菌的灭活杀菌所得出的发现。张根生等[12]发现过高的压力会使鲜鸡蛋的蛋白质变性、白度和粘度上升，起泡性和感官评分下降。由此可见，在适合的压力和温度组合条件下，超高压杀菌可以达到理想的效果。

本文以大肠杆菌和沙门氏菌为研究对象，考察超高压射流对微生物的杀灭效果，通过对灭菌效果评价选择最佳的超高压射流的压力和温度，为非热杀菌技术应用于果汁、蛋液等液体食品的杀菌提供参照基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli），ATCC8739NA；减毒鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），ATCC14028，实验室提供。

1.1.2 试剂

酵母提取物、蛋白胨、琼脂（北京奥博星）；氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等，均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

超高压射流设备，工作压力0～300 MPa，工作流量2.6 L/h，本实验室自制；电热恒温水浴锅HWS-28，电热恒温培养箱DHP-9162，上海一恒；高压蒸汽灭菌锅YM75FGN，上海三申；负压超净工作台FCH-900，北京亚泰科隆。

1.2 方法

1.2.1 微生物的活化

使用LB平板培养基，活化大肠杆菌菌种，37 ℃恒温培养24 h；沙门氏菌菌种接种到缓冲蛋白胨水培养基上，37 ℃恒温培养 24 h。将活化后的大肠杆菌、沙门氏菌用平板划线的方法分离出单菌落，从中挑出单菌落分别接种至LB斜面培养基，在4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 菌液的制备

用移液枪准确吸取2μL活化后的大肠杆菌、沙门氏菌培养液，分别接种到已编号的装有LB液体培养基的试管中，接种后振荡培养（150 r/min，30 ℃)，分别在0、3、6、9、10、12、15、18 h取样，放入4 ℃冰箱，以未接种的 LB培养基作空白对照，用600 nm波长进行比浊测定，测定吸光值，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。再以生长曲线划分出大肠杆菌不同生长期，根据生长曲线选取培养一定时间的菌液来达到大致控制杀菌过程中样品的初始菌数。

1.2.3 超高压射流处理菌液

在将料液置于进料口后由泵将料液吸入，设定压力后待压力上升到目标压力后进行射流处理，整个压力上升并稳定的过程约持续5 min左右。通过调整不同目标压力以达到测定不同压力的室温下，维持釜内的温度恒定，选取5个出口温度（20、25、35、40、45 ℃） ，研究不同的温度对于杀菌效果的影响；选取3个压力条件（100、200、300 MPa），探究不同的压力对于杀菌效果的影响。

1.2.4 微生物数量的测定

参照 GB/T 4789.2—2016《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》[13]，在样品杀菌前和杀菌后对菌液样品进行菌落总数检测。平板在恒温培养箱中倒置培养，设定培养温度为37 ℃，培养时间 48 h，培养完成后筛选出菌落数30～300 CFU之间的培养皿，根据稀释倍数计算原菌液的菌数。

1.2.5 致死率计算

参考李霜等[14]方法计算，微生物致死率用对数值log10S来表示。其表达式为：

式中：

Log10S——为前后菌落总数降低的对数；

N0——超高压处理前样品中菌落总数cfu/mL；

N——超高压处理后样品中菌落总数cfu/mL；

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌和沙门氏菌的生长曲线

根据实验条件培养大肠杆菌和沙门氏菌，通过测定吸光值，绘制大肠杆菌和沙门氏菌的生长曲线，结果见图1和图2。在培养前10 h，大肠杆菌与沙门氏菌的生长呈快速上升阶段，对应的菌液的吸光值也近乎呈直线上升，在培养10 h后两者的生长进入了平稳期，菌液的吸光值均不再变化，因此选择培养10 h后的大肠杆菌培养液和沙门氏菌培养液作为样品进行杀菌试验。

图1 大肠杆菌生长曲线

图2 沙门氏菌生长曲线

2.2 大肠杆菌的处理效果

在温度20、25、35、40、45 ℃和100、200、300 MPa压力条件下，进行杀菌试验，根据平板计数法计算大肠杆菌菌落总数和致死率，结果见图3和图4。

图3 不同温度下进样前后大肠杆菌菌落总数变化

图4 大肠杆菌致死率变化

由图3、图4可见，在20～45 ℃、200 MPa压力下处理对于大肠杆菌杀菌效果明显，当压力超过200 MPa大肠杆菌含菌量下降速度加快，随着温度升高，大肠杆菌的存活量下降速率明显减弱，随着温度和压力的升高大肠杆菌致死率也在上升，呈现先快后慢的趋势，在300 MPa 以上杀菌效果明显。

2.3 沙门氏菌的处理效果

在温度20、25、35、40、45 ℃和100、200、300 MPa压力条件下，进行杀菌试验，根据平板计数法测定沙门氏菌致死率，结果见图5和图6。

图5 不同温度下进样前后沙门氏菌菌落总数变化

图6 沙门氏菌致死率变化

由图5、图6可见，在20～25 ℃、100 MPa压力下处理对于沙门氏菌杀菌效果明显，当压力超过100 MPa进入了超高压阶段，沙门氏菌含菌量下降速度加快；随着温度上升，沙门氏菌的存活量呈下降趋势；温度和压力的升高，沙门氏菌致死率也在上升，呈现先快后慢的趋势，因此可以认为在200 MPa以上杀菌效果明显。

3 小结与讨论

本文利用超高压射流对大肠杆菌和沙门氏菌培养液杀菌，均引起两种微生物都不可逆转的损伤并致死。当在超高压时，结合不同温度与压力进行处理，大肠杆菌和沙门氏菌的含菌量急剧下降，随着超高压射流压力的上升，菌液中细菌的致死率逐步上升，呈现先快后慢的趋势；随着超高压射流温度的上升，两种微生物的减少趋势明显。

大肠杆菌与沙门氏菌为革兰氏阴性菌，属于敏感型致病微生物，革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖层很薄，所以对温度、压力越高就越敏感；大肠杆菌在25 ℃下，压力为300 MPa时即可被完全杀灭，而沙门氏菌在100～200 MPa时被完全杀灭。