不同血清学检测方法在人布鲁氏菌病诊断中应用价值比较

张亚楠，张亚慧，杨佳欣，高志祥，王占黎*

（1.包头医学院研究生院，内蒙古包头 014040；2.鄂尔多斯生态环境职业学院外语学院，内蒙古鄂尔多斯017010；3.内蒙古自治区综合疾病预防控制中心，内蒙古呼和浩特 010031；4.内蒙古自治区疾病相关生物标志物重点实验室，内蒙古包头 014040）

布鲁氏菌病（简称布病），是一种人、畜共患性全身传染性疾病，其病原菌是布鲁氏杆菌。布鲁氏杆菌的毒力或致病力很强，人类接触患病动物后，细菌可通过口、皮肤黏膜和呼吸道进入人体，产生的内毒素是主要的致病因子，可引起菌血症和毒血症[1]。布鲁氏杆菌进入人体后可侵袭到各个器官，包括脊柱、髋关节、膝关节、肩关节等部位。临床症状主要表现为波状热、多汗、乏力、关节疼痛。布鲁氏杆菌生存能力顽强，在干燥、低温的环境中均能存活，并且具有很强的抗灭活能力。因此，采取科学、合理检验方法有效防控布病，做到早发现早治疗尤为重要。本研究旨在探讨胶体金试纸条法、虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）和IgG/IgM酶联免疫吸附实验IgG/IgM法（ELISA IgG/IgM法）检测布鲁氏杆菌IgG抗体在布鲁氏菌病诊断中应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2021年12月19日就诊于内蒙古自治区综合疾病预防控制中心门诊的58例患者。纳入标准：因发热、多汗、关节痛、腰痛、咳嗽而就诊，具有流行病学接触史（与牛羊有所接触），疑似布病。神志清醒。排除标准：合并血液系统疾病及其他传染病。根据中国布鲁氏菌病诊断标准，SAT最低抗体滴度为1∶100，WHO和美国CDC将抗体滴度定为1∶160，结合我国具体国情和WHO诊断标准[1]，实验室初筛中加入了胶体金试纸条、ELISA IgG/IgM法等试验。

1.2 检验方法

1.2.1 胶体金试纸条法 取10 μL血清于胶体金试纸条加样孔中，滴加3滴稀释液，20 min后观察结果，如果检测线和质控线均出现条带，即为阳性；如果质控线出现条带，检测线没有出现条带，即为阴性；如果质控线没有出现条带，检测线出现条带或检测线和质控线均没有出现条带，即为无效样本。

1.2.2 RBPT 于检查当天清晨采集就诊患者空腹静脉血液5 mL，置于含分离胶的金黄色头盖真空采血管内，待血液凝固，3 000 r/min离心20 min，取血清备用。具体操作：用蜡笔在载玻片上划分方格，取30 μL血清样本于方格内，滴加等量布鲁氏杆菌病虎红平板抗原，用牙签混匀，室温静置持续观察结果5 min，如果血清出现凝集反应（浑浊、颗粒状或块状物质），即为阳性。

1.2.3 SAT 取5支试管备用。第1支试管加2.3 mL浓度的0.5%石碳酸生理盐水，第2支试管为空白对照管，不加生理盐水；第3、4、5支试管加0.5 mL 0.5%石碳酸生理盐水。向第1支试管中加0.2 mL血清样本，混匀后分别取0.5 mL血清稀释液于第2、3支试管中；将第3支试管中的混合液混匀后取0.5 mL加到第4支试管中，混匀后再从第4支试管中取0.5 mL混合液加到第5支试管中；最后从第5支试管中取0.5 mL混合液弃去。用0.5%石碳酸生理盐水稀释抗原，稀释比例1∶10，再分别将0.5 mL稀释后的抗原加到第2～5支中（稀释比例分别为1∶25，1∶50，1∶100，1∶200）。将5支试管充分震荡后，放到37℃恒温培养箱中20～22 h。取出试管后室温下冷却，观察试管的沉淀及清亮程度，并与比浊管比对。“-”无凝集，为均匀粉红色；“++”出现明显卷边，凝集块间液体稍清亮；“+++”凝集反应较强；“++++”凝集块呈菌丛状，凝集块间液体清亮明显。比浊管的配置，见表1。

表1 比浊管的配置

1.2.4 ELISA IgG/IgM法 加100 μL标准品和已稀释样本于相应反应孔中，封板后室温温育60 min。移去封板纸，弃去孔中液体，用300 μL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干，在每1微孔中加入100 μL酶联物。封板后室温温育30 min。移去封板纸，弃去孔中液体，再次用300 μL洗涤液洗板3次。每孔加TMB底物液100 μL，室温避光温育20 min。之后在每一微孔中加入100 μLTMB终止液以终止底物反应。轻轻摇动微孔板以使试剂混合均匀。加终止液后60 min内在450 nm处测OD值。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0统计学软件完成数据分析。一致性采用Kappa检验（Kappa＞0.75表明一致性极好，Kappa在0.4～0.75内表明一致性较为理想，Kappa＜0.4表明一致性差）；受试者工作特征（ROC）曲线计算每种方法的敏感度、特异度。

2 结果

2.1 4种方法检测58例患者血清结果 胶体金试剂条、RBPT、SAT、ELISA IgG/IgM法检测58例患者血清，结果显示，胶体金试纸条法检测布鲁氏杆菌IgG抗体呈阳性12例（20.69%），RBPT检测出16例阳性（27.59%），SAT检测出11例阳性（18.97%），ELISA IgG/IgM法检测布鲁氏杆菌呈阳性12例（20.69%），见表2。

表2 4种方法检测58例患者血清结果

2.2 4种方法诊断结果及效能分析 以4种方法检查结果为基础，进行诊断效能的计算，结果显示：RBPT检测出敏感度100.00%、特异度89.36%、阳性预测值68.75%、阴性预测值100%；胶体金试纸条法检测出敏感度81.82%、特异度93.62%、阳性预测值75.00%、阴性预测值95.65%；ELISA IgG/IgM法检测出敏感度100.00%、特异度97.87%、阳性预测值91.67%、阴性预测值100.00%，见表3、表4。

表3 4种方法检查结果

表4 4种方法诊断效能（%）

2.3 ROC曲线 胶体金试纸条ROC曲线下渐进95%置信区间为[0.737，1.000]，RBPT试验ROC曲线下渐进95%置信区间为[0.891，1.000]，ELISA IgG/IgM法试验ROC曲线下渐进95%置信区间为[0.965，1.000]，见图1。

图1 ROC曲线

2.4 4种方法可靠性及项间相关性分析 4种方法一致性分析采用Fleiss Kappa，且Fleiss Kappa值为0.934。各项之间相关性分析结果显示，胶体金试纸条法与SAT之间的相关性为0.730，RBT与SAT之间的相关性为0.784，ELISA IgG/IgM法与SAT之间的相关性为0.947，见表5。

表5 4种方法可靠性及项间相关性分析

3 讨论

布鲁氏菌病是国家二类动物疫病，也是人畜共患疾病，对养殖业和人类健康的危害特别大[2]。每年的第1季度末、第2季度初期和第3季度是布鲁氏菌传播的高峰期，应严格对动物进行检疫工作、疫苗接种，定期抽检调查动物及养殖场内的环境质量[3]。检疫工作一般选择细菌学诊断、全乳环状实验和血清凝集试验[4]。检疫工作时如若发现可疑目标，立即采取隔离观察或无害化处理，及时有效阻断布鲁氏杆菌的传播。因此，采用科学有效的实验室检查方法检测布鲁氏杆菌十分必要。

本文采用胶体金试纸条、RBPT、ELISA IgG/IgM法和SAT检测布鲁氏杆菌，结果表明：胶体金试纸条快速检测试验和RBPT为定性试验，准确度略低，易出现假阳性，但是检测速度快，可做大批量筛查；SAT和ELISA（IgG/IgM）法为定量试验，准确度高，但是SAT检测时间长，ELISA IgG/IgM法价格比较贵。4种方法有各自的优缺点，分析原因如下：胶体金试纸条法假阳性常见原因主要包括布鲁氏杆菌抗原间交叉反应、血清中的内、外源性物质干扰等。文献报道内源性干扰物质包括类风湿因子、嗜异性抗体、人抗动物抗体等，容易造成胶体金假阳性[5]。外源性干扰物质包括标本凝固不全便开始离心，血清中残留的纤维蛋白原黏附在硝酸纤维素膜上造成假阳性；此外试剂本身质量问题、溶血、乳糜血等原因均可对胶体金检测结果造成干扰[6]。胶体金双抗原夹心法、免疫层析法则容易产生假阴性。

RBPT主要检测项目是IgG抗体，具有较高的敏感度，且有操作简便、成本低廉、出结果快的优点，可用于大规模普查[7]。但是该方法易出现假阳性，会造成不必要的经济损失，并且加大工作人员的工作量[8]。相关文献报道，布鲁氏杆菌细胞壁脂多糖上的O-链抗原作为RBPT检测的诊断靶点，与大肠杆菌O157、沙门氏杆菌等O-链抗原具有高度相似性，容易发生交叉凝集反应导致假阳性[9]。抗原质量是影响RBPT结果的关键因素。此外，反应温度、时间、抗凝剂、纤维蛋白原和药物易对RBPT产生假阳性。根据布鲁氏菌病诊断标准（WS 269-2007）[10]要求反应在30 ℃、5 min后判断结果。有研究证明，虎红平板表面温度会对试验结果造成影响。商品化的纸质反应板难以控制温度，可通过加热玻璃反应板消除温度对实验造成的影响[11]。每次试验时须设立阴、阳性对照，在规定的时间范围内完成检测。血清样本放置的时间越长、温度越低，假阳性率越高。抗凝血的血浆中含有纤维蛋白原，带有正电荷的纤维蛋白原与带有负电荷的虎红发生静电结合，形成肉眼可见的超分子反应[12]。相比之下，SAT不受样本类型的影响，血清和血浆样本的检测结果一致。因此，RBPT试验采血时必须使用促凝管，要求血清样本新鲜透亮、无细菌污染和溶血，在规定温度和时间下进行检测。

ELISA相对RBPT和胶体金试纸条法敏感度和特异度更高，可避免人工操作带来的误差。该方法通过检测血清中的IgG、IgM，可有效鉴别急性、慢性布鲁氏菌病。但是，布鲁氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌0∶9的脂多糖在ELISA试验上可发生抗原交叉反应，常规上使用ELISA抑制试验测定布鲁氏菌属和耶尔森氏菌属抗体的特异度，并且该方法成本高，不适用于现场检查[13]。

SAT作为国际上推荐使用的检测方法，被当作布鲁氏菌病的确证试验。该方法不易受到非特异度抗体的干扰，假阴性检出率低，具有较高的敏感度和特异度，适用于布鲁氏杆菌临床诊断[14]。但是，SAT主要检测IgM类抗体，其维持时间较IgG抗体短，所以SAT阳性检出率低于RBPT。此外，SAT易受到人为因素的干扰，操作时间长，耗时24 h以上，检测时需用大量血清和布鲁氏杆菌凝集抗原。

综上所述，在临床实际血清学检查的工作中，RBPT敏感度高，ELISA敏感度高且特异度强。四种试验方法有各自的优缺点，可结合使用快速诊断布鲁氏菌病。另外，应该配合临床其他检查手段，比如超声、CT等综合判断布鲁氏菌病。最后，在治疗的过程中，应该科学治疗，对症下药，医患双方积极配合，做到早发现、早诊断、早治疗。