不同抗氧化剂对钴纳米粒子毒性的拮抗作用比较*

王 琛，张伟男，沈冀宁，刘 璠，刘雅克

（1 南通大学附属医院骨科，江苏 226001；2 江苏大学附属人民医院骨科）

关节置换术可以显著减轻患者关节疼痛，恢复关节功能，并提高患者生活质量[1]。由于金属对金属（metal-on-metal，MOM）假体脱位率及磨损率低，临床上被大量应用。随着时间的积累，部分关节置换术后患者出现慢性无菌性炎症和假体松动等不良反应，也有报告MOM 髋关节置换术后患者出现听力下降、视神经萎缩和足麻等神经系统症状[2]。产生不良反应的主要原因是假体长期磨损时产生的钴纳米粒子（cobalt nanoparticles，CoNPs）诱导的毒性[3-4]。CoNPs 诱导毒性的确切机制目前仍然未知。体外研究表明，钴毒性作用的主要靶细胞器是线粒体，CoNPs 影响线粒体氧化还原反应，产生大量活性氧（ROS），并消耗细胞内抗氧化物质如谷胱甘肽（GSH），进而诱导氧化应激，损伤溶酶体和细胞核，最终导致凋亡通路的激活[5-6]。CoNPs 还会引起细胞内炎症反应[7-8]，在需要翻修的假体周围组织中存在促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6[9]。慢性炎症可诱导氧化应激[10]，而氧化应激也可诱导炎性细胞因子[11]，二者均可造成细胞损伤。因此，寻找能够保护组织免于氧化应激和炎症的解毒剂是解决CoNPs毒性的首要目标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 Balb/3T3 小鼠胚胎成纤维细胞系（中国科学院细胞研究所）；CoNPs（30 nm，99.9%）（上海超微纳米技术有限公司）；培养基、胰蛋白酶-eDtA、胎牛血清和青霉素/链霉素（英国Gibco 公司）；组织培养皿（纽约康宁公司）；CCK8、GSH 和ROS 检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；小鼠TNF-α，IL-1β 和IL-6 ELISA 检测试剂盒（R&D Systems 公司）；乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）、抗坏血酸（ascorbic acid，AA）、褪黑素（melatonin，MT）和α-生育酚（α-tocopherol）（美国Sigma公司）。

1.2 细胞分组 Balb/3T3 细胞分为空白对照组（Control 组）、CoNPs 组、CoNPs+AA 组（AA 组）、CoNPs+NAC 组（NAC 组）、CoNPs+MT 组（MT 组）及CoNPs+α-tocopherol 组（α-tocopherol 组）6 个组。空白对照组：将Balb/3T3 细胞接种在96 孔板中，每孔约100 μL，不予任何处理。CoNPs 组：将Balb/3T3 细胞暴露于100 μL 不同浓度的CoNPs 4 h、24 h 和48 h。AA 组、NAC 组、MT 组、α-tocopherol 组：分别将不同浓度AA、NAC、MT 及α-tocopherol 预处理Balb/3T3 细胞4 h，再以CoNPs 刺激细胞4 h、24 h 及48 h。

1.3 CCK8 法检测细胞活力 在待测细胞中加入10 μL CCK8 试剂，37 ℃孵育2 h，酶标仪在450 nm处测量吸光度，细胞活力表示为对照组百分比。每个样品进行3 次重复分析。为了比较不同抗氧化剂对细胞活力的保护作用，先将用不同浓度AA、NAC、MT和α-tocopherol 预处理4 h 后的Balb/3T3 细胞后暴露于400 μmol/L CoNPs 24 h，再测定各抗氧化剂最佳浓度。然后以50 μmol/L AA、500 μmol/L NAC、100 μmol/ L MT 和10 μmol/ L α-tocopherol 预处理细胞，再进行400 μmol/L CoNPs 暴露。加入CCK8试剂，孵育后用酶标仪在450 nm 处测量吸光度。

1.4 活性氧测定 将细胞以1×105个/孔的密度接种在96 孔板中，分别以AA、NAC、α-tocopherol 和MT 预处理4 h，然后暴露于CoNPs 中24 h。DCFHDA 反应完成后，将反应混合物用PBS 洗涤3 次。使用荧光显微镜观察细胞，用酶标仪测量荧光强度。每个样品进行3 次重复分析。

1.5 GSH 含量测定 Balb/3T3 细胞按不少于1×105/孔密度接种于6 孔培养板，放入37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h。Balb/3T3 细胞经抗氧化剂预处理4 h 后，暴露于CoNPs 中24 h，PBS 洗涤后置于离心管中，1 000 g 离心5 min。取细胞沉淀置于5% 5-磺基水杨酸中均质化，反复冻融2 次溶解悬浮液，5 min 后10 000 g 离心10 min，收取上清液。根据GSH 试剂盒说明书操作，测量各组细胞中GSH 含量。每个样品进行3 次重复分析。

1.6 炎性细胞因子水平测定 细胞以1×105个/孔的密度接种在6 孔板中，37 ℃孵育24 h。先经抗氧化剂预处理4 h，再将细胞暴露于400 μmol/L CoNPs中24 h。收集细胞培养上清液，使用ELISA 试剂盒测定TNF-α、IL-1β、IL-6 浓度。每个样品进行3 次重复分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS 19.0（IBM SPSS，US）统计学软件对数据进行分析处理。计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，多样本比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 抗氧化剂对CoNPs 处理后的细胞活力影响 CoNPs 组Balb/3T3 细胞暴露于不同浓度CoNPs中4 h、24 h 和48 h 后，细胞活力较对照组均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），并呈剂量、时间依赖性。400 μmol/L CoNPs 孵育24 h 后，细胞活力降低约50%（图1a），随后的实验均采用400 μmol/L CoNPs 进行。AA、NAC、MT 和α-tocopherol 的最佳抗氧化浓度分别为50 μmol/L、500 μmol/L、100 μmol/L和10 μmol/L（图1c-f）。抗氧化剂预处理后各组细胞活力较CoNPs 组不同程度升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图1b），其中α-tocopherol 预处理组细胞活力高于其他抗氧化剂组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 抗氧化剂对暴露CoNPs 的Balb/3T3 细胞活力影响

2.2 抗氧化剂对细胞内ROS 生成的影响 暴露于CoNPs 中24 h 时细胞内ROS 含量较对照组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），经AA、NAC、MT和α-tocopherol 预处理后细胞内R0S 生成较CoNPs组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2），其中α-tocopherol 组细胞内ROS 含量明显低于其他抗氧化剂组（图3），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 荧光显微镜观察不同抗氧化剂处理后细胞内ROS 生成的影响

图3 不同抗氧化剂处理后细胞的相对荧光强度

2.3 抗氧化剂对细胞内GSH 含量的影响 与对照组比较，CoNPs 组细胞内GSH 含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。抗氧化剂预处理4 h 后各组细胞GSH 含量较CoNPs 组上升，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中α-tocopherol 组GSH 含量明显高于其他抗氧化剂组（图4），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 抗氧化剂对细胞内GSH 含量的影响

2.4 抗氧化剂对炎性细胞因子的影响 与对照组比较，CoNPs 组细胞培养上清液中TNF-α，IL-1β和IL-6 水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各抗氧化剂预处理后细胞培养上清液中炎症因子水平较CoNPs 组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中α-tocopherol 组上清液中IL-1β和IL-6 水平明显低于其他抗氧化剂组，而AA 组TNF-α 水平明显低于其他抗氧化剂组（图5），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5 AA、NAC、MT 和α-tocopherol 对CoNPs 刺激Balb/3T3 细胞24 h 后上清液中炎症因子水平的影响

3 讨论

人工关节置换术是许多关节疾病，如骨关节炎、缺血性坏死、某些股骨颈骨折的有效治疗方案。MOM 人工关节假体磨损导致金属颗粒释放到假体周围组织中[12]，随着假体植入时间的延长，不良反应逐渐出现，据预测到2030年髋关节总翻修率将提高137%[13]。金属磨损纳米级粒子可能在关节置换术后无菌性松动机制中发挥重要作用，而金属磨屑主要以钴铬纳米颗粒的形式存在，因此CoNPs 有可能是引起置换术后翻修的重要因素[14-15]。

现已发现多种通过抑制ROS 拮抗CoNPs 毒性的药物，如NAC、AA、MT、α-tocopherol 等。NAC 抗氧化活性归因于它与多种ROS 反应，如超氧化物、过氧化氢和过氧亚硝酸盐[16]。CoNPs 通过产生ROS 激活细胞凋亡信号通路，而AA 可降低ROS 水平从而抑制细胞凋亡[17]。褪黑素可清除细胞中的自由基，发挥重要的抗氧化作用[18]。α-tocopherol 是维生素E 生物利用度最高的形式，为脂溶性抗氧化剂，有助于减轻ROS 介导的损害[18]。此外，上述抗氧化剂均具有抗炎特性。

细胞内ROS 常作为评价纳米粒子毒性作用的关键指标[19]。ROS 具有调节细胞生长稳态的作用，但是过量ROS 会导致细胞损伤。GSH 是重要的抗氧化物质，在保护细胞对抗凋亡过程中发挥重要作用。GSH 损耗会促进细胞内ROS 堆积，促进细胞凋亡。本研究结果显示，CoNPs 刺激Balb/3T3 细胞4 h、24 h、48 h 后细胞活力较对照组明显降低，抗氧化剂预处理的各组细胞活力较CoNPs 组明显增加。CoNPs 刺激Balb/3T3 细胞24 h 后，细胞内ROS 含量升高，GSH 含量降低，各抗氧化剂组细胞内ROS 含量较CoNPs 组降低，GSH 含量升高，其中α-tocopherol 组ROS 含量较其他各抗氧化剂组更低，GSH 含量更高。以往研究表明，假体周围的磨损颗粒刺激多种促炎性细胞因子释放，如IL-6，IL-1β 和TNF-α[20-22]。本研究结果显示，CoNPs 刺激细胞24 h 后上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平显著上升，而各抗氧化剂预处理组炎症因子水平较CoNPs 组均降低，表明抗氧化剂对细胞的保护作用与抗炎有密切关系。

综上所述，CoNPs 刺激导致Balb/3T3 细胞活性显著降低,而抗氧化剂可以减轻CoNPs 的毒性，其中α-tocophero 降低ROS 含量，抑制炎症因子分泌的作用最强。虽然α-tocopherol 可以更有效减少CoNPs的细胞毒性，但不能完全逆转CoNPs 诱导的细胞凋亡，提示CoNPs 也通过其他非依赖ROS 的途径诱导细胞凋亡。因此，α-tocopherol 与铁螯合剂等非抗氧化剂的作用比较，及CoNPs 致细胞毒性的机制尚需进一步研究。