层粘连蛋白α3在膝关节纤维化发生发展中的作用研究*

侯靖钊，孙 钰，陈 辉

（1 靖江市人民医院关节外科，江苏 214500；2 苏北人民医院关节外科）

随着社会经济和医学的发展，各类膝关节手术开展越来越多，取得较好疗效，但膝关节纤维化是较常见的术后并发症，主要症状表现为关节疼痛、僵硬、活动度丢失以及软骨损伤和退变等，影响手术效果，导致患者满意度下降[1-2]。研究膝关节术后纤维化的发病机制，寻找新的干预靶点具有重要意义。膝关节术后纤维化是异常的伤口愈合反应，主要特征为细胞外基质（ECM）过度沉积及成纤维细胞聚集[3]。当膝关节损伤后，成纤维细胞募集至相关区域并被激活，分泌丰富的ECM 相关物质，其中包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白（laminins）[4]。层粘连蛋白是ECM 的主要成分，是由三种多肽链（α、β 和γ）组装成十字形或T 形的三聚体[5-7]，定位于基底膜，在细胞分化、迁移、粘附等过程中发挥关键作用。本文通过动物实验和细胞实验研究LAMA3 与膝关节术后纤维化的关系，以期为临床防治提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：雄性新西兰兔16 只，体重3.5～4 kg，购自仪征安立卯生物科技有限公司［生产许可证号码：SCXK（苏）2021-0006］，委托扬州大学实验动物中心进行饲养［SYXK（苏）2021-0026］。所用动物均单笼进行饲养，房间温度为20 ℃～25 ℃，湿度为30%～60%。

1.1.2 主要试剂：LAMA3 单抗、Cleaved-PARP 单抗、Bcl-2 单抗、Bax 单抗（Santa Cruz 公司，美国），PCNA 单抗、Cyclin D1 单抗、wnt3a 单抗、p-GSK 单抗、LAMA3 多抗、β-catenin 单抗（爱必信公司，中国），CCK-8 试剂盒（同仁化学，日本），EdU 试剂盒、Tunel 试剂盒（凯基生物，中国），LAMA3 过表达慢病毒（吉凯生物，中国），XAV-939（Med Chem Express公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 制备膝关节术后纤维化动物模型：兔麻醉后消毒备皮，暴露术区，取膝关节正中切口，经由髌腱内侧打开膝关节，充分显露股骨内外侧髁，离断前后交叉韧带。以电钻在股骨内外侧髁骨皮质分别造成10 mm×10 mm 缺损区。于术后2 周和4 周处死实验动物，取缺损区纤维化组织，经固定、脱水、透明及石蜡包埋等处理后制成切片标本。

1.2.2 苏木精-伊红（HE）染色：将切片标本经烤箱烘烤、脱蜡、水化、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水和封片等步骤处理后，显微镜下观察标本中术区的成纤维细胞数量，并进行统计学分析。

1.2.3 Masson 染色：将切片标本经烤箱烘烤、脱蜡、水化、苏木精染色、分化、返蓝、丽春红品红染色、清洗、苯胺蓝染色、弱酸工作液冲洗、脱水、透明及封片处理后，显微镜下观察标本中术区的胶原含量，并进行统计学分析。

1.2.4 免疫组织化学染色：将切片标本经烤箱烘烤、脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭、一抗孵育、冲洗、二抗孵育、DAB 复染、脱水及封片后显微镜下观察。

1.2.5 成纤维细胞培养：原代人成纤维细胞（Jenino Biotech 有限公司）复苏后置于完全培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱培养。待细胞密度达70%以上时进行传代，选择对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.6 构建LAMA3 过表达稳定株：按吉凯生物慢病毒转染说明书进行实验。取对数生长期成纤维细胞铺板，加入慢病毒试剂，观察荧光表达强弱情况，选择合适浓度进行后续实验。慢病毒转染后，加入嘌呤霉素筛选，扩增剩余细胞，即可得到LAMA3 过表达稳定细胞株。

1.2.7 EdU 染色：检测过表达LAMA3 基因对细胞增殖的影响。将成纤维细胞接种于6 孔板中，分为空白对照组、阴性对照组和LAMA3 过表达组。每孔加入EdU 试剂，继续培养2 h，随后滴加Hoechst 染色液复染，封片观察。实验步骤按EdU 试剂盒说明书进行。

1.2.8 XAV-939 抑制Wnt/β-catenin 信号通路：将成纤维细胞接种于6 孔板中，分为阴性对照组、LAMA3 过表达组、阴性对照组+XAV-939、LAMA3过表达+XAV-939 组，进行EdU 染色封片观察。

1.2.9 Tunel 染色：检测过表达LAMA3 基因对细胞凋亡的影响。将成纤维细胞接种于6 孔板中，分为空白对照组、阴性对照组和LAMA3 过表达组。每孔加入50 μL Tunel 试剂，避光孵育1 h。DAPI 复染后封片观察。实验步骤按CCK-8 试剂盒说明书进行。

1.2.10 Western-blot：检测过表达LAMA3 后相关蛋白的表达情况。将成纤维细胞接种于培养皿中，分为空白对照组、阴性对照组和LAMA3 过表达组，各组细胞培养后提取蛋白，定量后采用凝胶电泳分离蛋白，随后转膜、牛奶封闭，再用LAMA3 一抗在4 ℃下孵育过夜。TBST 清洗PVDF 膜3 遍后，滴加二抗，室温孵育2 h，最后进行显像。

1.3 统计学处理 应用SPSS 12.0 统计学软件进行数据分析处理。计量资料以±s 表示，组间比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝关节纤维化组织HE 染色、Masson 染色及免疫组化结果 HE 染色显示术后4 周时兔膝关节标本内成纤维细胞数量明显多于2 周时，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1A、B。Masson 染色显示术后4 周时兔膝关节标本内可见大量胶原及成纤维细胞沉积，其数量明显多于2 周时，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1C、D。免疫组化显示术后4周时兔膝关节标本内LAMA3 蛋白表达水平明显高于2 周时，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1E、F。

图1 膝关节术后纤维化组织中成纤维细胞数量、胶原含量及LAMA3 表达情况

2.2 过表达LAMA3 对成纤维细胞增殖的影响 成纤维细胞转染LAMA3 过表达慢病毒后进行嘌呤霉素筛选，成功构建稳定细胞株。Western blot 检测结果显示，与Control 组和OE-NC 组比较，OE-LAMA3组LAMA3 蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明慢病毒转染成功。见图2A、B。EdU 染色结果显示，成纤维细胞过表达LAMA3 基因后，细胞内DNA 合成能力显著上升，细胞增殖数量显著高于Control 组和OE-NC 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2C、D。Western blot 检测显示，LAMA3 过表达后，成纤维细胞增殖相关蛋白PCNA 及Cyclin D1 表达量较Control 组和OE-NC 组显著上升，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2E、F。

图2 过表达LAMA3 对成纤维细胞增殖的影响

2.3 过表达LAMA3 对成纤维细胞凋亡的影响 Tunel染色实验显示，LAMA3 过表达后阳性染色细胞数量明显少于Control 组和OE-NC 组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图3A、B。Western blot 检测结果显示，LAMA3 过表达后凋亡相关蛋白cleaved-PARP、Bax 表达明显下降，而Bcl-2 表达上升，Bax/Bcl-2 比率下降，与Control 组和OE-NC 组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3C、D。

图3 过表达LAMA3 对成纤维细胞凋亡的影响

2.4 LAMA3 通过Wnt/β-catenin 信号通路影响成纤维细胞增殖 Western blot 检测结果显示，过表达LAMA3 后成纤维细胞内Wnt3a、p-GSK、β-catenin蛋白表达上升，明显高于Control 组和OE-NC 组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图4A、B。EdU 染色显示，加入Wnt/β-catenin 通路抑制剂XAV-939后，过表达LAMA3 细胞增殖能力较OE-LAMA3 组明显下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图4C、D。

图4 LAMA3 通过wnt/β-catenin 信号通路影响成纤维细胞增殖

3 讨论

膝关节纤维化常发生于膝关节手术之后，是骨科常见并发症之一，导致患者膝关节活动度受限，制约膝关节术后功能[8]。虽然有诸多方法预防膝关节术后纤维化的发生发展，如局部注射药物几丁糖乃至各类手术，但疗效存在许多争议，寻找疗效确切的方法仍是亟待解决的问题[9-11]。目前，膝关节术后纤维化病理过程尚不明确，最近研究发现与细胞外基质过度沉积密切相关[12]。

成纤维细胞在膝关节术后纤维化的发生发展过程中发挥着关键作用。在膝关节损伤或者手术后，成纤维细胞被激活后迁移至损伤区域，分泌丰富的ECM 蛋白，这对于基底膜的结构和生理功能具有重要作用[13]。层粘连蛋白是ECM 主要成分，其主要作用是参与基底层的构建以及细胞各种生物学过程如迁移、增殖、分化以及粘附等[14-15]。

近来诸多实验发现，LAMA3 与纤维化疾病的发展密切相关。一项研究表明LAMA3 表达变化可以改变肺泡上皮对机械损伤的抵抗力，继而影响肺纤维化的发生和发展[16]。Wnt/β-Catenin 是细胞内极为保守的信号通路，在细胞发育过程中决定最终的分化结果[17]。Wnt/β-Catenin 通过与其他信号分子相互整合而发挥作用，如视黄酸、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子β（TGF-β）以及骨形态发生蛋白（BMP）等[18]。经典的Wnt/β-catenin 信号通路激活细胞核内相关靶基因，从而调控细胞各种生物学过程。既往研究提示，Wnt/β-catenin 通路在各种细胞增殖过程中具有重要作用[19-21]。此外，有报道称Wnt1过表达可促进小鼠心肌成纤维细胞增殖，从而导致心肌纤维化[22]。

本研究探究了LAMA3 通过Wnt/β-catenin 信号通路对膝关节纤维化的作用。动物实验发现，LAMA3 表达水平随着膝关节纤维化的发展而升高，说明LAMA3 表达水平与纤维化发生存在相关性，但具体机制尚不明确。进一步的细胞实验显示，成纤维细胞过表达LAMA3 后细胞DNA 合成能力上升，PCNA 与Cyclin D1 表达也随之上调，细胞增殖明显增加。Tunel 染色实验表明成纤维细胞过表达LAMA3 后，细胞凋亡受到抑制。Western blot 检测结果可见过表达LAMA3 后，Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白Wnt3a、p-GSK 与β-catenin 表达上调。EdU 染色结果显示，Wnt/β-catenin 信号通路被抑制时，过表达LAMA3 细胞的增殖能力明显降低。

综上所述，LAMA3 通过上调Wnt3a/β-catenin信号通路相关基因和蛋白表达，增强成纤维细胞增殖，抑制凋亡，最终促进膝关节纤维化的发生发展。