WSTF过表达的乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移能力变化及其机制

张顺礼，王雅琪，胡继卫，马杰，谷峥，王宇，蒋楠

唐山市人民医院乳腺外科，河北唐山 063000

乳腺癌是女性最常见的癌症之一，在女性恶性肿瘤中的病死率位居第二［1］。随着医疗技术的发展，乳腺癌患者手术治疗后的5年生存率显著提高，但是术后肿瘤复发和转移是乳腺癌治疗中的一个重大难题［2］。手术、放疗和化疗是目前临床上乳腺癌的主要治疗方式，但是化疗药物的耐药性导致治疗效果大大降低［3］。因此，了解影响乳腺癌细胞恶性生物学行为的相关机制，对于抑制肿瘤细胞的转移和侵袭具有重要意义。威廉姆斯综合征转录因子（WSTF）是一种多面蛋白，属于WAL/BAZ/WAC蛋白家族，该家族包含一个与植物同源结构域（PHD结构域）相邻的C-末端溴代半乳糖基序，与RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ基因调控、维生素D代谢、染色质装配和DNA修复等多种细胞功能有关，并参与基因转录的调控［4-5］。近期研究发现，WSTF可能通过形成不同的染色质重塑复合物而发挥不同的作用［6］。此外，WSTF具有WAC结构域的固有酪氨酸激酶活性和额外的N-末端区域，其在DNA损伤反应中起关键作用，因此可能决定DNA损伤后的细胞命运［7］。近年来研究显示，包括WSTF在内的溴代多糖蛋白与肿瘤发生相关［8］，但目前WSTF在乳腺癌发生发展中的作用及其机制尚未可知。为此，2021年6月—2022年6月我们进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料细胞：乳腺癌MCF-7细胞株购自成都匹拓生物科技有限公司。主要试剂：RPMI 1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、RNA反转录试剂盒均购自南京建成生物有限公司；慢病毒表达载体pLVXPRDX4、慢病毒干扰载体pLVX-shPRDX4、空载体pLVX-NC均购自上海捷瑞生物公司；qCCK-8、PCR试剂盒均购自上海优宁维生物有限公司，凋亡检测试剂盒购自美国Sun-Shine公司，RNA提取试剂盒购自武汉三鹰有限公司；WSTF、白细胞介素6（IL-6）、信号传导子及转录激活子3（STAT3）、β-actin蛋白抗体及二抗均购自美国Abcam公司。主要仪器：倒置显微镜、流式细胞仪购自意大利赛默飞公司；Bio-Rad微孔板阅读器、LAS 4000成像系统均购自美国GE Healthcare公司。

1.2 细胞分组及转染从液氮罐中取出乳腺癌MCF-7细胞株进行复苏，将复苏后的细胞置于RP⁃MI 1640培养基中，采用细胞培养皿进行分装，置于37℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养24 h，细胞融合率达70%后更换培养基，加入胰蛋白酶消化。将MCF-7细胞分为对照组、空载组、WSTF低表达组和WSTF高表达组。将空载组、WSTF低表达组和WSTF高表达组细胞接种于小皿中，37℃、5%CO2恒温环境中培养24 h，分别转染空载体pLVX-NC、慢病毒干扰载体pLVX-shPRDX4、慢病毒表达载体pLVX-PRDX4 10 μL，48 h后加入含5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基继续培养，以筛选稳转细胞株；对照组常规培养，不进行处理。

1.3 细胞生物学行为观察

1.3.1 细胞增殖能力采用CCK-8法。取各组细胞，加入胰蛋白酶1 mL，轻微吹打2 min，使细胞完全悬浮。将悬浮的细胞转移到1.5 mL离心管中，2 000 r/min离心10 min，弃上清；加入RPMI 1640培养基1 mL，充分悬浮细胞。取一块新的96孔板，每孔加入细胞悬液100 μL，培养箱中培养24 h后弃去培养基，加入新的RPMI 1640培养基培养24 h，弃去培养基，加入培养液100 μL和CCK-8溶液10 μL，培养3 h。每组设置6个复孔。Bio-Rad微孔板阅读器读取450 nm处的吸光度（OD）值，计算细胞存活率。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 细胞凋亡能力采用流式细胞术。将各组细胞用PBS吹洗两次，1×结合缓冲液悬浮细胞，调整密度为1×106/mL，加入Annexin V-FITC 5 μL，黑暗中室温孵育15 min；加入PI 10 μL，4℃避光孵育5 min，上流式细胞仪计算细胞凋亡率。实验重复6次，取平均值。

1.3.3 细胞侵袭能力采用改良Matrigel Boyden小室实验。在有基质胶的滤膜上接种各组细胞，制备密度为5×105/mL的细胞悬液，配置10%的FBS作为趋化剂，将趋化剂放在滤膜下仓室。将滤膜置于培养箱中培养24 h，对滤膜染色。在每个滤膜上随机选择5个视野，计数每个视野的细胞数即为侵袭细胞数。实验重复6次，取平均值。

1.3.4 细胞迁移能力采用划痕实验。将各组细胞制备5×105/mL的细胞悬液，接种于6孔板内，置于培养箱中培养48 h。划痕实验时将吸头垂直孔壁作一划痕，加入无血清培养基。划痕完成后培养48 h，使用EVOS M7000倒置显微镜观察，计算细胞划痕愈合率。

1.4 细胞中WSTF、IL-6和STAT3 mRNA检测采用qRT-PCR法。取各组细胞，应用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录生成cDNA。按照PCR试剂盒说明书配置反应体系，进行PCR反应，各基因引物序列见表1。PCR反应体系：引物2.25 μL，cDNA 3.0 μL，SYBR Green qPCR SuperMix 17.25 μL，去酶水7.5 μL。PCR反应条件：94℃、12 min，96℃、12 s，62℃、25 s，72℃、40 s；共35个循环。采用2－ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表1 WSTF、IL-6、STAT3及内参GAPDH引物序列

1.5 细胞中WSTF、IL-6和STAT3蛋白检测采用Western blotting法。取各组细胞，配置蛋白酶K溶液（PBS 1 mL加入蛋白酶K 100 μL），弃去培养皿中的培养液；加入蛋白酶K溶液1 mL，4℃条件下3 000 r/min离心20 min，用加样枪将上清转移至

1.5 mL EP管中。经SDS-PAGE电泳分离、转膜和封闭，加入WSTF、IL-6、STAT3和内参β-actin一抗（稀释比例均为1∶5 000），4℃条件下孵育12 h，孵育后的条带清洗3次；加入二抗（稀释比例均为1∶1 000），室温条件下孵育2 h。LAS 4000成像并观察结果，计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法采用SPSS22.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk法正态性检验，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞存活率、细胞凋亡率、划痕愈合率及细胞侵袭数比较见表2及OSID码图1。

表2 各组细胞存活率、细胞凋亡率、划痕愈合率及细胞侵袭数比较（xˉ±s）

2.2 各组细胞WSTF、IL-6和STAT3 mRNA相对表达量比较见表3。

表3 各组细胞WSTF、IL-6和STAT3 mRNA相对表达量比较（xˉ±s）

2.3 各组细胞WSTF、IL-6和STAT3蛋白相对表达量比较与对照组和空载组比较，WSTF低表达组WSTF、IL-6和STAT3蛋白相对表达量均降低，WSTF高表达组均升高（P均<0.05）。见表4、OSID码图2。

表4 各组细胞WSTF、IL-6和STAT3蛋白相对表达量比较（xˉ±s）

3 讨论

尽管手术治疗显著延长了乳腺癌患者的生存时间，但晚期患者的预后仍然不理想［9］。由于致癌/抑癌基因的多样性和组织类型特异性，许多致癌/抑癌蛋白在乳腺癌中的特定调节功能尚未完全阐明［10］。WSTF是一种由1 425个氨基酸组成的蛋白质，其功能目前尚不明了［11］。WSTF分子中包含一个PHD型锌指基序和一个溴代半乳糖，通常在转录调节器中发现，这表明WSTF可能作为转录因子而发挥作用［12］。此外，WSTF通过促进DNA损伤后的细胞凋亡来调节DNA损伤反应，因此在提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性方面具有潜在作用［13］。

目前有研究利用公开的恶性肿瘤mRNA表达谱数据结合TCGA数据分析，确定了WSTF与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关［14］。研究显示，在乳腺癌MCF-7细胞中WSTF表达显著高于正常细胞，提示WSTF可能是乳腺癌的一种致癌基因［15］。本研究结果显示，WSTF高表达组细胞存活率、划痕愈合率、侵袭细胞数均显著升高，细胞凋亡率显著降低，提示WSTF过表达可抑制乳腺癌MCF-7细胞凋亡，并促进其增殖、迁移和侵袭水平；这说明WSTF过表达加速了肿瘤细胞的生长和转移，表明WSTF作为一种癌蛋白，通过促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭而发挥作用。同时本研究结果发现，WSTF低表达组细胞存活率、划痕愈合率、侵袭细胞数均显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示沉默WSTF表达可促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡，并抑制其增殖、迁移和侵袭，对于临床乳腺癌的分子靶向治疗具有一定的参考价值。

上皮—间质转化（EMT）是上皮细胞失去细胞极性，细胞与细胞之间黏附而成为间充质细胞的过程。间充质细胞具有迁移和侵袭特性，EMT对于乳腺癌进展中的转移启动至关重要［16］。目前研究显示，WSTF过表达可引起E-cadherin表达降低，而Ecadherin是EMT的标志，在转移性肿瘤中经常丢失［17］。研究显示，PI3K/AKT和IL-6/STAT3等致癌信号通路可激活EMT，在肿瘤的发生和侵袭过程具有重要作用［18］。IL-6/STAT3信号通路已经被证实参与不同因子诱导的EMT［19］。MENG等［14］在对肺癌细胞的研究中发现，WSTF能通过激活IL-6/STAT3信号通路而促进EMT，从而加速肺癌细胞的侵袭和增殖。本研究结果显示，WSTF低表达组IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表达均显著降低，而WSTF高表达组均显著升高，提示WSTF可能通过调控IL-6/STAT3信号通路而影响乳腺癌细胞的EMT过程，参与对乳腺癌细胞恶性生物学行为的调控。

综上所述，WSTF过表达可抑制乳腺癌细胞凋亡，并促进其增殖、迁移和侵袭，其机制可能与激活IL-6/STAT3信号通路有关，而沉默WSTF表达则具有相反的作用，为乳腺癌的靶向治疗提供了新的参考依据。