E6/E7 mRNA检测筛查妊娠期高危型人乳头瘤病毒感染的价值研究

杨咏梅，王凤英*，廖秦平，肖群，康宁，吴洁

宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）的持续感染密切相关［1］。病毒与宿主DNA整合实现逆转录被认为是宫颈病变恶性进展的一个重要标志［2-3］。针对HR-HPV DNA的检测方法灵敏度高，但特异度低，阳性检测结果无法准确判断是否伴有宫颈组织学高级别病变，反而易造成过度治疗导致医疗资源浪费［4］。妊娠期宫颈病变的诊治要同时考虑对孕妇和胎儿的影响，因此更应审慎。但HR-HPV感染，如不能明确有无宫颈病变，一方面易给孕妇造成不必要的精神负担，另一方面也易造成宫颈癌的漏诊。在非妊娠期女性中，应用E6/E7 mRNA检测宫颈癌较DNA检测具有同样的临床灵敏度及阴性预测值，同时特异度较高，可降低阳性预测值的假阳性率［5-6］。但是E6/E7 mRNA检测是否可以用于妊娠期HPV感染的诊断与管理，尚无有效的试验支持。本研究将妊娠期HR-HPV感染E6/E7 mRNA载量检测与HR-HPV DNA检测进行对照比较，以宫颈活检病理结果为金标准，探讨将E6/E7 mRNA检测应用于妊娠期HR-HPV感染及宫颈病变诊断与分流管理，提高诊断效能，从而减少妊娠期非必要的有创检查。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2019年1月在首都医科大学宣武医院妇产科建档定期产检的20～45岁育龄妊娠期女性为研究对象，均为单胎妊娠，既往体健，无内外科合并症及免疫抑制性疾病，未服用任何免疫抑制性药物，均签署知情同意书。

纳入标准：（1）2次以上薄层液基细胞学检查（TCT）结果为不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）伴HR-HPV DNA检测阳性；（2）TCT结果显示病变程度在ASCUS以上伴/不伴HR-HPV DNA检测阳性；（3）HR-HPV DNA检测结果为HPV 16、18亚型。

排除标准：拒绝签署知情同意书；拒绝行阴道镜检查及宫颈活检。

1.2 样本采集与处理 研究对象进行TCT及HR-HPV DNA检测，结果异常者进一步行阴道镜检查并取活组织送病理检查，同时留取宫颈脱落细胞，检测HR-HPV E6/E7 mRNA 片段。

1.2.1 TCT样本的采集与处理 研究对象取膀胱截石位，围绕宫颈顺时针方向旋转5～7周，采集宫颈外口及宫颈管的脱落细胞。病理科制片后由2名细胞病理专家在不知道HR-HPV DNA检测结果的情况下阅片进行诊断，按2001国际癌症协会（NCI）推荐的The Bethesda System（TBS）方式进行报告。如诊断存疑，请第3位上级专家协助，共同做出诊断。本研究将2次检测为ASCUS、ASCUS以上和各级腺细胞异常记为TCT结果异常。

1.2.2 HR-HPV DNA样本采集方法及处理 应用快速导流杂交基因芯片技术结合低密度基因芯片技术（HPV GenoArray Test kit，Hybribio Ltd. Hong Kong）对标本进行HR-HPV DNA分型检测，鉴别21种HPV基因亚型，包括15种高危型亚型：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 以 及 6 种低危型（6、11、42、43、44和 CP8304）。

1.2.3 阴道镜样本采集与处理 对于TCT结果异常或HR-HPV DNA检测结果阳性的妊娠期研究对象，如存在以下情况：液基细胞学TBS报告中提示2次结果为ASCUS伴HR-HPV DNA检测阳性；或病理结果显示病变程度在ASCUS以上伴或不伴HR-HPV DNA检测阳性；或HPV 16、18亚型感染，采用德国LEISEGANG公司的光学电子数码阴道镜，由2名经过专业培训经验丰富的妇科医师进行操作及检查。病理结果解读：在不知道HR-HPV DNA检测结果及TCT结果的情况下，由2名病理学专家共同阅片确定最后病理结果。病理检查结果分为正常或炎症、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ级、CINⅡ级、CINⅢ级、宫颈浸润癌。将CINⅠ级及正常或炎症定义为宫颈低级别病变及正常，将CINⅡ级、CINⅢ级定义为宫颈高级别病变。

1.2.4 HR-HPV E6/E7 mRNA 样本采集方法及处理留取行阴道镜检查的妊娠期女性宫颈脱落细胞，检测HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种高危亚型的HR-HPV E6/E7 mRNA片段。本研究以HR-HPV E6/E7 mRNA 拷贝数≥1 copy/ml为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行数据整理与统计学分析。计数资料以相对数表示，比较采用Pearson χ2检验、McNemar配对χ2检验。灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值采用传统列联表计算。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人口学特征 本研究共调查20～45岁健康单胎妊娠女性1 058名，其中孕早期322名、孕中期374名、孕晚期362名，平均年龄（29.8±3.3）岁。1 058名妊娠期女性中，TCT结果异常和/或HPV 16、18亚型者118名，同意行阴道镜检测并成功获得病理检查结果者84名。病理检查结果显示正常或炎症21例、CINⅠ级34例、CINⅡ级18例、CINⅢ级11例。

2.2 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测与病理检查结果比较 在病理检查结果为CINⅠ级及正常或炎症的女性中，HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性率均低于HR-HPV DNA检测阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）；在病理检查结果为CINⅡ级及CINⅢ级的女性中，HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 84名行病理检查的妊娠期女性HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性率比较〔n（%）〕Table 1 Comparison of HR-HPV DNA testing，HR-HPV E6/E7 mRNA detection and pathological examination results in 84 pregnant women

2.3 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测预测宫颈高级别病变的效能 McNemar配对χ2检验结果显示：HR-HPV E6/E7 mRNA检测预测宫颈高级别病变的灵敏度低于HR-HPV DNA检测，特异度高于HR-HPV DNA检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；Pearsonχ2检验结果显示：HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测预测宫颈高级别病变的阳性预测值、阴性预测值比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2～3。

表2 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测预测宫颈低级别病变及正常、高级别病变情况〔n（%）〕Table 2 Comparison of HR-HPV DNA testing，and HR-HPV E6/E7 mRNA detection in predicting low- and high-grade cervical lesions

表3 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA检测预测宫颈高级别病变的效能Table 3 Comparison of diagnostic efficacy of HR-HPV DNA testing and HR-HPV E6/E7 mRNA detection for high-grade cervical lesions

3 讨论

2019 年美国阴道镜和宫颈病理学会（ASCCP）宫颈癌筛查结果异常和癌前病变的管理共识提出基于HPV筛查、结合患者风险评估的精确管理模式，使诊断、治疗和随访的建议更加个性化［7］。

关于妊娠期合并CIN的发生率国内外报道并不一致（0.08%～5.00%）［8-9］。吴霞等［10］报道北京地区妊娠期宫颈上皮细胞异常发生率为3.95%，与非妊娠期3.22%的发生率相近。妊娠期由于宫颈柱状上皮异位，局部组织被柱状上皮覆盖，组织菲薄，毛细血管丰富，在阴道镜检查中易引起出血，严重状态下需宫颈局部缝扎止血，增加宫颈损伤。此外妊娠期女性常对阴道操作存在抵触情绪，不愿进行检查，造成宫颈病变尤其是恶性宫颈病变的漏诊，最终影响母婴安全。最新研究提示，妊娠期HPV感染可经由母体通过阴道传播至子代，造成子代罹患肺癌的风险增加［11］。但由于目前HR-HPV DNA检测的特异度尚不能令人满意，单纯HPV检测结果阳性反而给妊娠期女性造成一定的心理和经济负担，诱发围生期孕妇精神状态异常，间接影响妊娠期母婴安全。基于妊娠期宫颈病变的特点，诊疗过程中既要避免过度诊疗，同时亦不能遗漏宫颈浸润癌的诊断。因而目前迫切需要一种具有良好的诊断效能，既能有效地诊断出宫颈高级别病变，又能使漏诊率降到最低的检测手段。

国外很多学者对HR-HPV检测阳性人群的分流方法进行了大量相关试验，其中包括宫颈TCT、分型检测HPV 16、18亚型，分型检测HPV 16、18、31、33、45亚型高危病毒以及进行p16或Ki67免疫组化等多种方法［12］。

机体宫颈组织发生HR-HPV持续感染后，在一定条件下，通过E6/E7癌基因转录形成E6/E7 mRNA，最后翻译成E6/E7癌蛋白，作用于宿主细胞，最终发挥致癌作用。由此可见，E6/E7 mRNA的转录表达是宫颈恶性病变发生、发展的必由之路，也是HPV病毒致癌活性的一个标志，因而可以通过对其复制转录检测，达到预测病变进展风险的目的。

国外研究显示，非妊娠期HR-HPV DNA检测对诊断CINⅡ级及以上病变的灵敏度优于HR-HPV E6/E7 mRNA检测，为70%～100%，而HR-HPV E6/E7 mRNA检测的灵敏度一般在60%～90%，但HR-HPV E6/E7 mRNA检测在特异度上要高于HR-HPV DNA检测［13-14］，尤其对于预测宫颈病变进展方面优于HR-HPV DNA检测［15-16］，因而考虑可将其应用于HR-HPV检测阳性人群的分流。但目前将HR-HPV E6/E7 mRNA检测应用于妊娠期宫颈病变诊断的研究相对较少。故而本研究将其应用于妊娠期宫颈高级别病变的诊断，以期为妊娠期宫颈病变，尤其HPV阳性人群的诊断分流提供相关思路。

由于CINⅡ级及以上病变进展为宫颈浸润癌的发生率极大增加，因而本研究将宫颈高级别病变作为重点观察指标，评价HR-HPV E6/E7 mRNA检测对于CINⅡ级及以上宫颈病变的诊断效能。在CINⅠ级及正常或炎症结果中，HR-HPV E6/E7 mRNA检测的阳性率低于HR-HPV DNA检测，而在CINⅡ级及CINⅢ级检测结果中，两者阳性率无统计学差异；考虑造成HR-HPV E6/E7 mRNA 检测在早期宫颈病变中阳性率低的原因为病毒处于相对静默期，由于绝大部分CINⅠ级可自行消退，因而很可能仅停留在HPV感染整合期，而未进展到 E6/E7癌基因大量转录复制的地步，因而其阳性检测率较低。将HR-HPV E6/E7 mRNA 检测对宫颈高级别病变的检测灵敏度与特异度和HR-HPV DNA检测比较，发现HR-HPV E6/E7 mRNA 检测的特异度较高，而灵敏度较低。

综上所述，HR-HPV E6/E7 mRNA检测可以在一定程度上提高CINⅡ级及以上宫颈高级别病变的诊断特异度，但存在灵敏度稍低的可能。因而考虑是否将HR-HPV E6/E7 mRNA检测应用在TCT结果为正常或ASCUS及低度鳞状上皮内病变（LSIL），而HR-HPV DNA检测阳性（尤其HPV 16、18亚型）结果的基础之上，作为风险评估的一部分，进行阴道镜检查的分流指导，避免妊娠期非必要有创检查，做到更为精准的个体化诊疗。

作者贡献：王凤英、廖秦平负责文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析；杨咏梅、肖群、康宁、吴洁负责数据收集；杨咏梅负责数据整理、统计学处理、结果分析与解释、撰写论文；杨咏梅、王凤英负责论文修订；王凤英对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

本研究局限性：

妊娠期是女性极为特殊的生理时期，此时期的相关检查尤其有创检查需考虑母婴两方面，尽量保证双方安全最大化，因而所采取的诊断方法需慎之又慎。因客观条件所限，本研究薄层液基细胞学检查（TCT）结果异常和/或高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）检测结果阳性标本例数较少，故而所得结论尚需进一步随机大样本试验支持，同时研究时限较短，未能监测阳性病例远期宫颈恶性肿瘤发生情况及子代HR-HPV相关性疾病发生情况。未来研究需扩大样本量，以论证本研究所得结果。