粪菌移植干预治疗溃疡性结肠炎的免疫学机制研究

翁剑锋，徐佳，刘朋，葛巍，陈教华，彭迎迎，胡家丽，崔曼曼，张磊昌*

本研究创新性：

本项目从传统医学和现代医学两个方面探讨粪菌移植（FMT）和肠道菌群的相关性，拟为FMT干预溃疡性结肠炎（UC）提供中医和西医双重理论支持，且本项目创新之处在于将FMT和中药金汁进行联系，首次从中药的角度分析FMT的药物性味，并基于转录因子→CD4+T细胞→细胞因子通路分析其干预UC的可能机制，有望为FMT干预UC奠定中医中药和免疫学理论基础。

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的范畴，是主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症，临床以腹痛、腹泻、黏液脓血便等为主要表现［1］，以发作、缓解及复发交替为疾病特点，好发于直肠和乙状结肠，多见于20～40岁青壮年人群，是消化系统的常见病、多发病、疑难病［2］。近年来，UC的发病率及向结肠癌转化率升高，已逐渐成为全球重点关注的疾病之一，但关于UC的病因、发病机制尚不明确［3］。现代医学认为其是在遗传、环境、心理等多种因素的共同影响下，导致肠黏膜屏障损伤，神经内分泌功能失调和免疫失衡，从而引起肠黏膜局部溃疡而发病，免疫状态紊乱是其公认的发病机制之一［4］。

目前针对UC尚无治愈的方法，药物治疗本病原则上以控制急性发作、黏膜修复、维持缓解、减少复发、预防并发症为主，治疗药物包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素类等［4］。但药物不良反应较强，病情容易反复。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是指将健康人粪便中的功能菌群，采用某些方式移植入患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，治疗肠道及肠道外某些疾病。该方法由来已久，且在2013年治疗难辨梭状芽孢杆菌感染被写入美国食品药品监督管理局指南，其安全性及有效性进一步得到了印证，适应证得到进一步扩展［5］。

许多研究表明UC发病还与免疫细胞、炎性细胞因子的参与有关联，免疫调节的失衡会导致炎性细胞和炎性递质释放异常，最终引发肠黏膜组织损害［2］。本研究以阳性药物5-氨基水杨酸（5-ASA）为实验对照，通过FMT治疗湿热型UC模型验证其疗效，通过检测不同种类T细胞、相关炎性因子含量，探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性C57BL/6小鼠（4周龄），共60只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司〔许可证号：SCXK（湘）2019-0004〕，在常温常态下适应性饲养1周。本实验获得江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（审批编号：JZYYLL20200420007）。

1.2 实验试剂与仪器 葡聚糖硫酸钠（DSS）（货号：9011-18-1，上海源叶生物科技有限公司）；5-ASA（货号：89-57-6，上海源叶生物科技有限公司）；高脂高糖饲料（配方：糖15%、猪油10%、胆固醇4%、胆盐0.3%、蛋黄粉10%、基础饲料60.7%，南京盛民科研动物养殖场）；便隐血（OB）试剂（批号：B200101，珠海贝索生物技术有限公司）；水合氯醛（批号：119957，上海展云化工有限公司）；异氟烷（批号：S10010533，上海玉研科学仪器有限公司）；干扰素γ（IFN-γ）PE（505808，Biolegend）；白介素（IL）-17A PE（506904，Biolegend）；FOXP3 Alexa Fluor® 488（126406，Biolegend）；CD4 APC-CY7（100460，Biolegend）；CD25 PE（101904，Biolegend）；IL-4 PE（504104，Biolegend）；True-NuclearTMTranscription Factor Buffer Set（424401，Biolegend）；Fixation/Permeabilization Solution Kit（554714，Biolegend）；小鼠IL-2试剂盒（MM-0701M1，酶免）；小鼠IL-4试剂盒（MM-0165M1，酶免）；小鼠IL-10试剂盒（MM-0176M1，酶免）；小鼠IL-17试剂盒（MM-0170M1，酶免）；小鼠转化生长因子β（TGF-β）试剂盒（MM-0689M1，酶免）；小鼠IFN-γ试剂盒（MM-0182M1，酶免）；人工气候箱（PRX-80A，江苏天翔仪器）；动物呼吸麻醉机（ABM-100，上海玉研科学仪器）；透射电镜（JEM-1230，JEOL）；流式细胞仪（NovoCyte 2060R，艾森生物）；多功能酶标仪（S/N502000011，TECAN）； 显 微 镜（CX41 OLYMPUS）；切片机（BQ-318D，伯纳）。

1.3 实验分组与动物造模 2019年12月至2020年4月，采用随机数字表法将小鼠分为4组，每组各15只，分组如下：（1）正常对照组（Control组）：不进行任何干预处理，给予小鼠自由饮用正常水，普通饲料喂养，常温常态下饲养，不进行其他特殊处理；（2）UC模型组（Model组）：造模成功后，常温常态下普通饲料正常饮水饲养，给予磷酸盐缓冲液（PBS）0.2 ml/次对小鼠进行灌肠，1次/2 d，持续10 d，共计5次；（3）UC模型+粪菌移植治疗组（Model+FMT组）：造模成功后，常温常态下普通饲料正常饮水饲养，给予制备的粪菌液0.2 ml/次对小鼠进行灌肠，1次/2 d，持续10 d，共计5次；（4）UC模型+5-ASA治疗组（Model+5-ASA组）：造模成功后，常温常态下普通饲料正常饮水饲养，按照0.195 g/kg的剂量，5-ASA药物浓度为0.019 5 g/ml，即20 g小鼠灌肠0.2 ml，1次/2 d，持续10 d，共计5次。

UC模型造模：将小鼠适应性饲养7 d后，置于鼠笼饲养IVC系统（设置参数如下：温度36 ℃、湿度80%，每日持续12 h）中饲养，给予高脂高糖饲料，并给予小鼠自由饮含2% DSS蒸馏水，连续饲养10 d即可。

粪菌（fecal microbiota，FM）制备：取Control组小鼠的5 g新鲜晨便，取标本溶于10 ml无菌PBS中充分混匀，分别用2.0、1.0、0.5、0.25 mm的不锈钢筛过滤，以6 000×g离心15 min，取菌体，用无菌PBS清洗3次，重悬于25 ml PBS中，4 ℃冰箱保存。

1.4 动物取样 给药结束后，将各组小鼠用10%水合氯醛按照400 mg/kg腹腔注射麻醉，打开动物的腹腔及胸腔，用1 ml注射器抽取0.02 ml饱和EDTA溶液润管，从小鼠心脏处采血，收集血液用于流式细胞检测；将结肠和盲肠取出，表面血迹冲洗干净，内容物取出后切去盲肠，用于透射电镜检测、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。

1.5 透射电镜观察 各组组织样品2.5%戊二醛固定2 h以上，用0.1 mmol/L磷酸漂洗，1%锇酸固定液固定2 h，0.1 mmol/L磷酸漂洗梯度乙醇（50%～90%）溶液脱水，再用丙酮脱水，包埋固化，切片切成厚度为70 nm薄片。3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，透射电镜观察。

1.6 流式细胞检测 辅助性T细胞（Th）17细胞检测：各组取100 μl血液置于12孔板中，加入150 μl 1640完全培养基，加入1 μl PMA/Ionomycin mixture佛波酯/离子霉素混合物，放入培养箱中孵育30 min后加入1 μl BFA/Monensin Mixture，放入培养箱中孵育24 h。结束后，将血液转至EP管中离心，弃150 μl上清液，将细胞吹匀加入CD4 APC-CY7各5 μl，避光孵育15 min，1 ml PBS，400×g离心5 min清洗2次，弃上清液。加入500 μl Fixation/Permeabilization Solution避光固定破膜40 min，400×g离心5 min后，加入1 ml 1×BD Perm/WashTMbuffer，清洗2次，再100 μl 1×BD Perm/WashTMbuffer重悬细胞，加入5 μl IL-17A PE，避光孵育15 min。1 ml 1×BD Perm/WashTMbuffer，清洗2次，再500 μl 1×BD Perm/WashTMbuffer重悬细胞，上流式细胞仪检测。

Th1、Th2细胞检测步骤同上，CD4 APC-CY7孵育重悬后，其中Th1检测加入IFN-γ PE孵育，Th2检测加入IL-4 PE孵育；Treg细胞检测步骤同上，CD4 APCCY7孵育重悬后，加入FOXP3 Alexa Fluor® 488孵育。

1.7 ELISA 检 测 将 IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β试剂盒中所有试剂取出恢复到室温，并对上述指标进行检测，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μl。分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。每孔加入酶标试剂100 μl，空白孔除外，用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干洗涤，拍干。每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 ml，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl，终止反应，450 nm波长测量各孔的OD值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透射电镜分析 各组肠组织透射电镜超微结构显示：Control组微绒毛形态规则，排列整齐，较多杯状细胞，线粒体丰富，嵴结构清楚，粗面内质网未见改变；Model组上皮细胞表面微绒毛稀疏，长短不一，形态不规则，细胞连接间隙增宽，杯状细胞减少，胞质内有空泡，线粒体肿胀，部分嵴消失，个别内质网扩张或呈空泡变化；Model+FMT组与Model+5-ASA组微绒毛较为致密，形态正常，杯状细胞数目较多，线粒体轻微肿胀，粗面内质网病变不明显，见图1。

2.2 流式细胞检测 各组Th17、Th1、Th2、Treg细胞含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）；其中Model组Th17细胞含量高于Control组，Model+FMT组Th17细胞含量高于Control组、低于Model组，Model+5-ASA组Th17细胞含量低于Control组、Model组、Model+FMT组；Model组Th1细胞含量高于Control组，Model+FMT组、Model+5-ASA组Th1细胞含量均分别低于Control组、Model组；Model组Th2细胞含量低于Control组，Model+FMT组Th2细胞含量低于Control组、高于Model组，Model+5-ASA组Th2细胞含量低于Control组、高于Model组和Model+FMT组；Model组Treg细胞含量低于Control组，Model+FMT组、Model+5-ASA组Treg细胞含量均分别低于Control组、高于Model组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、图2。

表1 各组小鼠肠组织中Th17、Th1、Th2、Treg细胞含量比较（±s，ng/L）Table 1 Comparison of Th17，Th1，Th2，and Treg cell content in intestinal tissues of mice in each group

表1 各组小鼠肠组织中Th17、Th1、Th2、Treg细胞含量比较（±s，ng/L）Table 1 Comparison of Th17，Th1，Th2，and Treg cell content in intestinal tissues of mice in each group

注：a表 示 与 Control组 相 比 P＜0.05，b表 示 与 Model组 相 比P＜0.05，c表 示 与 Model+FMT组 相 比 P＜0.05；Th=辅 助 性 T细胞，Control组=正常对照组，Model组=溃疡性结肠炎模型组，Model+FMT组=溃疡性结肠炎模型+粪菌移植治疗组，Model+5-ASA组=溃疡性结肠炎模型+5-氨基水杨酸治疗组

组别 只数 Th17 Th1 Th2 Treg Control组 15 0.88±0.15 8.86±3.00 7.71±1.30 5.94±1.24 Model组 15 5.60±1.00a 28.20±3.30a 1.76±1.01a 0.97±0.51a Model+FMT 组 15 1.77±0.30ab 12.50±2.22ab 3.70±1.61ab 3.64±1.28ab Model+5-ASA 组 15 0.47±0.12abc 11.09±2.07ab 4.65±1.21abc 4.20±0.85ab F值 189.191 160.214 54.751 61.371 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 ELISA 检测各组 IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β细胞含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中Model组IFN-γ细胞含量高于Control组，Model+5-ASA组IFN-γ细胞含量低于Model组；Model组IL-2细胞含量高于Control组，Model+FMT组、Model+5-ASA组IL-2细胞含量低于Model组；Model组IL-17细胞含量高于Control组，Model+FMT组、Model+5-ASA组IL-17细胞含量均分别低于Control组和Model组，Model+5-ASA组IL-17细胞含量低于Model+FMT组；Model组IL-4细胞含量低于Control组，Model+FMT组IL-4细胞含量低于Control组、高于Model组，Model+5-ASA组IL-4细胞含量高于Model组；Model组IL-10细胞含量低于Control组，Model+FMT组IL-10细胞含量高于Control组和Model组，Model+5-ASA组IL-10细胞含量高于Model组；Model组TGF-β细胞含量低于Control组，Model+FMT组、Model+5-ASA组TGF-β细胞含量均分别低于Control组、高于Model组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β细胞含量比较（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IFN-γ，IL-2，IL-17，IL-4，IL-10，TGF-β cell levels in each group of mice

表2 各组小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10、TGF-β细胞含量比较（±s，ng/L）Table 2 Comparison of serum IFN-γ，IL-2，IL-17，IL-4，IL-10，TGF-β cell levels in each group of mice

注：a表示与Control组相比P＜0.05，b表示与Model组相比P＜0.05，c表示与Model+FMT组相比P＜0.05；IFN-γ=干扰素γ，IL=白介素，TGF-β=转化生长因子β；各组分别有6只小鼠存在技术操作原因造成脱落

组别 只数 IFN-γ IL-2 IL-17 IL-4 IL-10 TGF-β Control组 9 147.98±22.57 57.42±10.37 6.01±0.95 23.48±2.62 97.49±5.56 130.79±17.55 Model组 9 183.65±27.12a 73.87±14.64a 12.56±1.73a 10.48±1.73a 57.93±11.46a 76.30±14.12a Model+FMT 组 9 160.33±43.92 49.57±12.24b 4.36±0.89ab 20.35±2.39ab 118.00±10.85ab 104.88±11.63ab Model+5-ASA 组 9 142.31±33.65b 52.17±7.59b 2.96±0.87abc 22.00±4.26b 109.84±22.82b 98.88±11.87ab F值 2.811 8.089 119.367 36.873 31.883 23.051 P 值 0.048 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

UC是一种消化系统的慢性炎症性疾病，其病变主要累及结肠黏膜层，以溃疡病变为主，临床以反复发作的腹泻、黏液脓血便、腹痛为主要表现。微生物群在代谢、免疫和肠道保护上具有重要的作用和功能。抗菌因子和定植抗性的产生是肠道菌群调控的重要手段方式，其可以通过拮抗营养物质和受体，阻止潜在致病菌的生长。在正常情况下，人体内肠道微生态结构处于动态平衡的“稳态”结构，但在诸多研究中，明显发现UC患者和实验性UC小鼠肠道内处于菌群紊乱失衡的状态，其表现出致病菌增多、有益菌减少的状态［2，7］。而针对于此，近年来，从中医药出发探索治疗UC的临床疗效颇为明显，也为研究肠道菌群与UC的相关性提供了一个新的角度和策略。根据本研究透射电镜超微结构结果分析，FMT对UC模型小鼠有显著的疗效，且效果不弱于5-ASA。流式细胞检测结果表明FMT可以改善T细胞比例，使UC模型中Th1细胞与Th17细胞显著减少，Th2细胞与Treg细胞显著增多。ELISA结果表明FMT可以使UC模型中IFN-γ、IL-2、IL-17降低，IL-4、IL-10、TGF-β升高，趋于正常水平。本研究结果表明，FMT治疗UC的机制可能与改善肠道菌群结构，酸化肠道抑制致病菌生长，提高肠道抗炎代谢物如短链脂肪酸的水平、增加有益菌丰度、改善Th1/Th2细胞平衡和Th17/Treg细胞比例、调节促炎因子与抗炎因子的平衡、诱导机体免疫系统对肠道菌群产生免疫耐受等多方面相关［8］。

本研究结果显示，Model组Th1、Th17较Control组明显增加，Th2、Treg明显出现反向减少，但在Model+FMT组 及 Model+5-ASA组 中，Th1、Th17较Control组和Model组均出现减少，而Th2、Treg均增加，表明无论是FMT还是5-ASA对UC均有抑制促炎因子生成、增加抗炎因子水平的作用，且Model+FMT组中Th1、Th17低于Model+5-ASA组，而Th2、Treg相对较高，同样的情况也出现在ELISA检测结果中，IFN-γ、IL-2、IL-17出现降低，而IL-4、IL-10、TGF-β升高，趋于正常水平，且Model+FMT组上述指标增减趋势较Model+5-ASA组更为明显，因此，从中可以推论FMT及5-ASA对UC均有良好的疗效，且FMT疗效相对优于5-ASA。众所周知，T淋巴细胞在机体的免疫应答和免疫调节作用中占据中心地位，Th细胞为初始CD4+T细胞活化后分化而成的效应细胞，其通过释放细胞因子、辅助B细胞活化产生抗体，以及和细胞间直接接触的方式发挥免疫效应［9］。在受到不同性质抗原和局部微环境中细胞因子调控后，Th细胞主要可分化为Th1、Th2亚型。Th1细胞以分泌IL-2、IFN-γ等为主，参与细胞免疫应答、炎性反应和急性排斥反应过程；Th2细胞以分泌IL-4、IL-5为主，参与体液免疫应答［10-11］。根据本研究结果，UC模型中Th1细胞占据主导，FMT治疗后，转变为以Th2细胞为主导，Th1/Th2平衡趋于Control组。Th17细胞是新发现的一种独特Th亚群，其在TGF-β、IL-6、IL-23等多种细胞因子参与发生活化，并通过分泌IL-17、IL-22等细胞因子，参与炎性反应、细菌感染免疫应答和自身免疫性疾病等过程［12］。研究显示，Th17细胞及其相关因子IL-17、IL-21在UC活动期表达增多，并随着疾病活动程度增加呈逐渐上升趋势［13-14］。Treg是一类具有负调节作用的CD4+CD25+Foxp3+T细胞亚群，Foxp3是其重要转录因子，不仅是Treg的标志，也参与Treg的分化和功能调节［15］。研究表明Treg通过释放TGF-β、IL-10等细胞因子发挥免疫抑制功能，Treg与炎性肠病的发病关系紧密。通过流式细胞检测UC患者治疗前后外周血Treg细胞的数量，治疗后明显增多，可以认为其参与了UC的发病。

综上可知，FMT可改善UC模型小鼠，且效果明显，推测其发挥功效的可能是通过调节Th1/Th2细胞平衡，Th17/Treg细胞比例，达到治疗的目的，本研究为FMT治疗UC提供了理论依据，但还需更进一步深入的研究。

作者贡献：翁剑锋进行文章的构思与设计，对文章整体负责，监督管理；张磊昌进行研究的实施与可行性分析，负责文章的质量控制及审校；胡家丽、崔曼曼进行数据收集；刘朋、陈教华、彭迎迎进行数据整理；陈教华、彭迎迎进行统计学处理；葛巍、胡家丽、崔曼曼进行结果的分析与解释；翁剑锋、徐佳撰写论文；徐佳、刘朋进行论文的修订。

本文无利益冲突。