中医药治疗慢性心力衰竭的网络药理学研究进展

孙梓宜，张天雅，王子涵，黄 力

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)作为多种心血管疾病的终末阶段，是一种导致高住院率、高死亡率的疾病，给公共卫生系统带来了重大负担。虽然新的治疗方案不断涌现与优化，但5年的死亡率仍约为50%[1]。中药复方是很好的新药开发资源，其临床疗效已在几千年的中医临床实践中得到了证实，有望为心力衰竭病人带来福祉，但其多成分、多靶点、多效应的作用机制是中医药研究的难题。网络药理学可利用各种组学技术或者高通量手段筛选出药物活性成分，经过多组学网络融合，找到与这些活性成分所对应的关键节点蛋白，通过对关键节点蛋白进行生物富集分析，进而揭示中药的有效成分及其作用机制。它可以系统地将药物、化合物、靶点和疾病之间的相互关系呈现出来。网络药理学已经成为研究多成分、多途径、多靶点的中药复方的重要方法，对于新药的开发以及阐明药物背后的分子机制具有指导作用[2]。随着网络药理学概念的提出，涌现出大量中药单体及复方治疗慢性心力衰竭的网络药理学相关研究，基于此，本研究旨在通过对相关文献进行系统梳理，以总结目前研究概况并为未来的研究提供参考与借鉴。

1 网络药理学的主要研究方法

在过去的很长一段时间，通过设计具有最大选择性的配体作用于单个药物靶点是药物发现的主要主导模式。然而，许多有效的药物是通过调节多个蛋白质而不是单个靶点发挥作用的。基于此背景，2008年，Hopkins[3]首次提出网络药理学的概念，将生物信息学、系统生物学与多向药理学联合应用于药物的设计。因网络药理学所强调的“多靶点”“协同机制”与中医理论所强调的“整体观念”“辨证论治”不谋而合，故一经提出许多中医学者就尝试将其应用于中药及复方的开发与预测方面[4]。为解决中草药配方的分子基础研究所面临的复杂性等问题，2011年，李梢[5]首次提出了“网络靶标”的概念，其可通过将方药、病证映射于生物分子网络中，以网络为基础建立方药与病证的关联机制。网络药理学以及“网络靶标”概念的提出，打开了中药及复方研究的潘多拉魔盒，大量相关研究相继涌现。

网络药理学通过整合多学科领域的大量信息，将实验与计算相结合从而预测、发现新的药物及作用网络。实验方法包括各种高通量组学技术与生物和药理实验，计算方法包括数据挖掘、建模、图论、统计方法和信息可视化等方法[3]。而中药网络药理学研究方法包括对中药复方中有效成分的鉴定、基于药物算法的靶标预测、活性成分对应靶标的筛选、基于网络的疾病基因预测、疾病特异性网络的构建以及最终的药物-基因-疾病共模块的定量分析[6]。

2 网络药理学研究的常用工具

2.1 药物活性成分的筛选及靶点预测的数据库 目前常用的药物活性成分的筛选及靶点预测的数据库包括：①中药系统药理学平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[7]收录了近500味中草药的近2.9万个的活性成分及对应的靶点蛋白，可根据药物的吸收、代谢、分布(ADME)参数筛选中药的活性成分及对应靶标，是目前最常用的数据库之一。②本草组鉴数据库(HERB，http://herb.ac.cn/)[8]是由北京中医药大学开发的包含大量高通量的中医药实验的数据库，收集并重新分析了1 037个用中药或中药成分处理的高通量测序实验，支持对中药、成分、靶标以及疾病的检索与预测。③SwissTargetPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)[9]是基于相似性原理，通过反向筛选预测可能的小分子靶点蛋白，可用于中药活性成分靶标的反向预测。④其他常用的数据库还有中医药整合药理学研究平台(TCMIP，http://www.tcmip.cn)[10]、中药信息数据库(TCMID，http://bidd.group/TCMID/index.html)[11]、BAT-MAN(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)数据库[12]、Pharmmapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)[13]数据库等。

2.2 疾病靶点筛选的数据库 目前常用于疾病靶点筛选数据库包括：①GeneCards(https://www.genecards.org/)[14]数据库将150个网络基因数据中心进行整合，包含了基因组、转录组、蛋白组以及临床疾病的蛋白靶点，是十分全面的综合性数据库。②DrugBank(https://go.drugbank.com/)[15]数据库，包含已批准的药物2 358个，还包括数百种药物对代谢物水平(药物代谢组学)、基因表达水平(药物转录组学)和蛋白质表达水平(药物原生学)影响的信息。③OMIM(https://www.omim.org/)[16]数据库，由Victor A. McKusick博士在19世纪60年代初期创建，目前以包含超过1.6万个基因的信息，并仍在不断更新。④其他常用的数据库还有TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[17]数据库、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)[18]数据库等。

2.3 蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络的构建及生物富集分析的数据库 生命体的活动依赖于生物分子之间的相互作用，PPI网络可以展示靶点在蛋白水平上的相互作用关系。STRING(https://cn.string-db.org/)[19]数据库覆盖了1.4万多个物种之间的蛋白网络，整合了所有已知的与预测的蛋白质之间的关联，包括物理相互作用和功能关联，是常用的构建PPI网络的数据平台。生物富集分析可选择的数据库包括DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[20]数据库，其是一个集合了注释、可视化和集成发现的数据库，可以提供差异表达基因的功能注释与分析微阵列数据。Metascape(https://metascape.org/)[21]数据库整合利用40多个独立的知识库，可以提供全面的基因列表注释和分析资源，结合了功能丰富分析、交互组分析、基因注释和成员搜索等功能，是提供生物富集分析的高效工具。同时常应用Cytoscape[22]软件对网络进行网络的构建及可视化展示。

3 中药活性成分及单药防治慢性心力衰竭的网络药理学研究

中药活性成分是中药中具有医疗效用或生理活性的单体化合物，是新药研发、药品制备的重要途径来源。谭鑫等[23]应用网络药理学和分子对接技术探索槲皮素治疗慢性心力衰竭的分子机制，得到与慢性心力衰竭相关80个靶标，筛选出了蛋白激酶B1(AKT1)、胱天蛋白酶3(CASP3)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、基质金属蛋白酶9(MMP9)和MAPK8共5个关键靶点，细胞实验表明槲皮素可明显降低心力衰竭细胞AKT1、Phospho-AKT(Ser473)、 内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、MMP9和Caspase-3水平(P<0.01)，并得出结论：槲皮素可能通过调节AKT1-eNOS-MMP9通路抑制凋亡从而改善慢性心力衰竭。Zhu等[24]运用网络药理学方法研究雷公藤甲素治疗糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的作用机制，筛选出信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、FOS、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤蛋白p53(TP53) 和转化生长因子-B1(TGFB1)共6个关键靶点。富集主要集中在晚期糖基化受体终末产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路、胰腺癌、MAPK等信号通路上。Luo等[25]通过TCMSP数据库筛选出了葶苈子包含12个活性成分以及所对应的29个慢性心力衰竭相关靶标蛋白，通过对网络的分析以及富集分析，认为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素为发挥治疗作用的主要活性成分，β2肾上腺素能受体(ADRB2)、血红素加氧酶1(HMOX1)为关键靶标，可能通过调节AGE-RAGE信号通路、低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、雌激素信号通路而发挥治疗作用。Tao等[26]运用网络药理学方法确定了黄芪中所包含的21种有效成分以及对应的407个靶标，通过网络构建共获得46个交集靶点蛋白，对交集蛋白进行生物富集分析后显示，黄芪在调节AGE-RAGE、白细胞介素-17(IL-17)、HIF-1等信号通路方面具有潜在作用。李昊楠等[27]通过整合多个数据库，筛选获得人参所包含的33种活性成分，以及与心力衰竭相关的STAT3、 c-Jun蛋白(JUN)、白细胞介素-1β(IL-1β)、TNF等靶点，富集分析结果表明，人参治疗心力衰竭可能涉及环磷酸腺苷(cAMP)、TNF、胰岛素抵抗、甲状腺激素等共55条信号通路，为人参治疗心力衰竭的临床应用提供了科学依据。

4 中药复方防治慢性心力衰竭的网络药理学研究

相较于中药的活性成分与单味中药，中药复方更符合中医的辨证论治特点，临床治疗中也多是以复方的形式进行辨证治疗。目前已有较多学者将网络药理学应用于研究中药复方防治慢性心力衰竭的作用机制中[28-31]。Xu等[32]的研究发现，参附汤可以提高心力衰竭大鼠的射血分数，减轻心肌组织病理学改变，降低血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、醛固酮(aldosterone，ALD)、心房利钠肽(atrial natriuretic polypeptide，ANP)和肾素(renin，REN)水平。并进一步通过网络药理学与分子对接技术筛选出参附汤所作用的22个核心靶点蛋白，利用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术发现参附汤可能通过乌头碱(aconitine，AC)、苯甲酰胺(benzoylaconine，BAC)、人参皂苷 Re(Ginsenoside Re)、人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)、人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)作用于ACE2、REN、ACE、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、表皮细胞生长因子(EGF)、人5-羟色胺受体2B(HTR2B)、多聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)、重组人B型钠尿肽(NPPB)等蛋白发挥协同作用改善心力衰竭。Liu等[33]通过整合多个数据库，筛选出了芪参益气颗粒所包含的243种生物活性成分与129个交集靶点，确定了内皮素1(EDN1)、血管紧张素原(AGT)、cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)、ACE等10个关键靶标，并通过进一步的聚类及富集分析筛选出与慢性心力衰竭相关的神经活性配体-受体相互作用信号通路、环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信号通路、肾素分泌、血管平滑肌收缩和肾素-血管紧张素系统等信号通路。孙梓宜等[34]联合网络药理学与分子对接技术探讨升解通瘀汤治疗慢性心力衰竭的潜在作用机制，通过联合多个数据库信息以及网络的拓扑分析，最终确定75个药物活性成分及109个与慢性心力衰竭相关的靶标蛋白，认为升解通瘀汤可能通过调节免疫炎症反应、细胞的增殖和凋亡、血管生成和氧化应激等生物学过程发挥治疗作用。Wu等[35]将网络药理学与动物实验相结合，通过网络药理学方法确定了63 个养心氏片包含的与心力衰竭进展密切相关的主要靶点，富集分析显示养心氏片治疗心力衰竭与氧气输送、葡萄糖利用和线粒体生物发生等通路有关。进一步的实验表明养心氏片可以通过增加磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、Akt、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6(rpS6)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化来促进下游低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC1α)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达，通过激活PI3K/Akt/mTOR/rpS6/HIF-1α和AMPK/PGC1α/GLUT4信号通路改善慢性缺血性心力衰竭大鼠的心肌能量代谢障碍，对于养心氏片活性化合物的确定、潜在靶点以及分子机制明确具有重要意义。

5 网络药理学所面临的问题与挑战

中药网络药理学的出现丰富了中医药的研究策略，对于靶标的发现、生物活性成分的筛选、毒性评价、药效作用背后机制的阐释以及中药的研发具有重要意义，同时中药网络药理学方法为中医药从经验医学向循证医学系统的转化提供了一种新的研究范式[36]。但目前网络药理学仍存在一定局限，首先，网络药理学的数据来源于现有数据库，而数据的准确性与完整性直接决定了结果的可靠性。同时现有数据库的数据纷繁复杂，如何对数据进行筛选以及保证结果的可重复性也是不容忽视的问题。其次，对于关键活性成分以及靶标的确定多是依据不同的模型与算法，而不同的算法往往会产生不同的预测结果，选择何种算法并保证预测结果的准确性仍需进一步研究。再次，中药方剂的配伍讲究“君、臣、佐、使”，根据治法的要求，有主有次，有专攻有配合，而网络药理学中“药物-有效成分”的对应关系仅仅是中药中化学成分的简单相加，这有悖于中医的组方理论。尹文萱等[37]分别制备了人参、附子的单煎液与合煎液，结果表明，人参与附子的合煎液与单煎液的结构发生了变化，合煎液中有新的物质产生，各味中药在合煎过程中存在着复杂的相互作用，因此不能将中药复方简单理解为单种药物活性成分的简单加和。最后，对于药物活性成分的确定多以口服生物利用度(OB)、类药性(DL)作为标准，但却忽视了成分含量对药效的影响，同时，不同中药的剂量不同其功效也大不相同，如中药三七，小剂量可散瘀止血，大剂量具有活血作用，因此，将所有药物按统一标准等同对待显然也是不合理的[38-39]。

6 小结与展望

即使在网络药理学的研究中存在着一些不可避免的局限性，但它仍为复杂的中药配方提供了一个多维的研究策略。随着网络药理学研究的不断深入以及仪器分析和数据分析手段的进步，希望能够在中医理论的指导下、在充分认识到中药组方内在逻辑的基础上，找到一种超高通量、快速、准确的方法来有效解决上述局限，从而进一步推动中医药的现代化进程。