microRNAs在急性肺栓塞中的研究进展

金 钊，施熠炜

肺栓塞(pulmonary embolism，PE)是以各种栓子阻塞肺动脉或其分支为其发病原因的一组疾病或临床综合征的总称，其中肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism，PTE)为肺栓塞最常见类型。引起PTE的血栓主要来源于下肢的深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)，二者合称为静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism， VTE)。二者具有相同易患因素，是VTE在不同部位、不同阶段的两种临床表现形式[1]。

作为全球第三大急性心血管综合征，VTE位于心肌梗死与脑卒中之后[2]。流行病学研究表明，肺栓塞年发病率为39/10万～115/10万，深静脉血栓年发病率为53/10万～162/10万[3-4]。随着年龄增加，VTE发病率增加，年龄>40岁较年轻病人风险增高，其风险大约每10年增加1倍[5]；而在老年人中更为明显，年龄≥80岁人群VTE发病率几乎是50岁人群的8倍[3]。PTE致残率和致死率都很高，其7 d全因病死率为1.9%～2.9%，30 d全因病死率为4.9%～6.6%[6]。此外，初始治疗前6个月内为VTE全因病死率高峰期，随后明显下降[7]。以上的流行病学研究表明，VTE的早期有效诊治仍面临巨大挑战。

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)是一种常见的突发的具有高发病率及死亡率的VTE[8]，其临床表现多样化，缺乏可靠的筛查方式，漏诊率较高。早期及时准确的诊断非常关键，主要包括实验室标志物及影像学检查。D-二聚体是纤维蛋白降解产物，升高反映继发性纤溶亢进，诊断肺栓塞具有高度敏感性，但其特异性较低，即阴性具有排除价值，而阳性仍需进一步检查[9]。肺动脉造影曾是诊断的金标准，因其有创性已逐渐被CT肺血管造影(CTPA)取代，但肾功能不全以及对造影剂过敏等病人无法行CTPA检查。总之，早期及时并准确诊断APE的新型无创生物标志物的研究非常必要。

microRNA(miRNA)是内源性小分子非编码单链RNA，通过结合靶基因mRNAs 3′非翻译区抑制其翻译[10]。循环miRNAs在内源性RNA酶的保护下较为稳定，易于收集且重复度高，是一种简便可靠的生物标志物，疾病状态下，可从细胞中被动或选择性地释放进入血液，作为信号交流的信使[11]，于血浆或血清中迅速灵敏地定量检测到，在心血管系统疾病方面已有广泛的研究。此外，miRNAs与CTPA相比无创且没有辐射，与D-二聚体相比则往往有更高的诊断准确性。miRNAs对早期准确诊断APE具备很高的价值，同时参与了APE的发病机制通路。本研究对microRNA在APE中的研究进展进行综述。

1 miRNA-134与miRNA-1233

miRNAs用于诊断APE最早在Xiao等[12]的一项前瞻性研究中提出。该实验收集了APE组32例、健康对照组32名、非APE组22例，通过Taqman微阵列分析筛选出30种差异化表达的miRNAs，并通过Taqman miRNA 实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测3组miRNA-134，结果显示，APE组血浆miRNA-134明显高于健康对照组及非APE组，首次提出miRNA-134可作为诊断APE的潜在生物标志物。但该研究存在一定的局限性，如样本数量相对较小，没有结合临床指标(如D-二聚体)探究更高的诊断准确性，同时未涉及miRNA-134的生物学功能、相关病理生理学机制及其对APE诊断模式的价值等。

Liu等[13]的Meta分析系统地评价了循环miRNA-134对于早期诊断APE的临床价值。该Meta分析发现，APE组血清或血浆中miRNA-134明显高于对照组，其整体灵敏度与特异度都很高，反映了miRNA-134对APE的诊断准确性较高。由于D-二聚体的灵敏度高及特异度低，其阴性常用于APE的排除诊断，该Meta分析提出miR-134联合D-二聚体对准确诊断APE可能优于单一指标。该Meta分析也存在一定的局限性，其收录文献较少，且不同文献具有异质性。尽管存在局限性，该Meta分析阐释了miRNA-134可作为APE早期诊断的新型生物标志物。

非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)具有与APE难于鉴别的临床症状(如呼吸困难与胸痛)，早期识别这两种致命性胸痛并给予针对性治疗对改善预后非常关键，而常用的肌钙蛋白及D-二聚体并不足以将二者有效鉴别。Kessler等[14]首次提出miRNA-1233可作为鉴别二者的生物标志物，且具有高度的灵敏度(90%)及特异度(100%)。该研究测序了肺栓塞急性期(第1天)与慢性期(9个月后)的754种miRNAs，发现了37种差异化表达的miRNAs，其中miRNA-1233在急性与慢性肺栓塞中差异最明显，并通过RT-qPCR验证了其在NSTEMI组及健康组中明显的差异化表达。但由于缺乏可靠的床旁测量技术及正常值范围，miRNAs用于临床早期鉴别APE与NSTEMI尚需更多研究。该研究仍存在一定的局限性，如样本量较小以及实验组为高选择性高栓塞风险的中心型栓塞重症病人。该研究首次提出miR-1233作为鉴别诊断APE与NSTEMI具有高度准确性，可作为诊断APE更有前景的生物标志物。

随着以上两种miRNA在APE中的研究愈发广泛，Peng等[15]为早期鉴别慢性阻塞性肺疾病(COPD)是否合并APE，通过qRT-PCR检测miRNA-134与miRNA-1233表达，结果显示慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)合并APE组miRNA-134与miRNA-1233表达较COPD稳定期及急性加重期组明显上调。在APE组中，miRNA-134的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.931，miRNA-1233的AUC为0.884，二者AUC均高于D-二聚体(AUC 为0.628)，经年龄调整后的D-二聚体(AUC 为0.705)及Wells评分(AUC 为0.705)，提示miRNA-134和miRNA-1233可作为鉴别诊断AECOPD是否合并APE的潜在生物标志物。该研究还表明miRNA-134联合miRNA-1233(AUC为0.957)诊断准确性高于单一miRNA，以及二者分别联合经年龄调整后的D-二聚体对诊断准确性无明显提高。该研究为单中心小样本研究，而且因科室特殊性收集的AECOPD均为中重度，长期缺氧且活动不足，具备血栓形成高危因素。

2 miRNA-27a/b 与miRNA-221

不同miRNAs在诊断APE的研究也有所不同。Wang等[16]收集了78例APE病人与70名年龄、性别匹配的健康人，通过qRT-PCR检测血浆miR-27a与miR-27b表达，结果显示，APE组血浆miR-27a与miR-27b明显增高，且miR-27a(AUC为0.784)优于miR-27b(AUC为0.707)，并且miR-27a或miR-27b联合D-二聚体明显增加了APE诊断的准确性。该研究也有一定的局限性：首先，这项单中心研究的样本量仍相对较小；其次，该研究只测量了APE病人出现症状6 h以内的miRNA含量，并未测量其后续水平，且相关机制尚未明确；最后，miRNA的标准化正常范围仍未确定。此外，Liu等[17]纳入了60例APE病人及50名正常人，通过miRNA微阵列分析鉴别出血浆中差异化表达的32种miRNAs，并应用qRT-PCR验证了miR-221(AUC为0.823)在APE组明显上调，其程度与肺栓塞风险性增加相关，miR-221表达量与脑钠肽(BNP)、肌钙蛋白I及D-二聚体呈正相关，且其对于APE诊断的准确性更高。该研究也存在局限性，同其他实验一致为单中心、小样本研究；而且测序miRNA数量较少，无法确定有无其他miRNA参与APE进展；此外，因miRNA严格的时空特异性也无法确定miR-221是否为APE早期特异性标志物。

3 miRNA let-7i-5p与miRNA-320a

Fabro等[18]研究了经时间变化的PTE及不同表型肺动脉高压miRNA的差异，并预测了相应miRNA的靶基因。该研究比较了急性肺血栓栓塞症(APTE)与慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)中miRNA的改变，以及CTEPH与特发性肺动脉高压(IPAH)中miRNA的差异，发现了5个差异最明显的miRNA。APTE组miR-let-7i-5p、miR-320a、miR-320b-1、miR-320b-2及miR-1291上调；CTEPH组miR-320b-1上调，miR-let-7i-5p、miR-320a、miR-320b-2及miR-1291下调；而在IPAH组miR-let-7i-5p与miR-320b-1上调，miR-320a和miR-1291下调。与对照组相比，APTE组miR-let-7i-5p和miR-320a明显上调，CTEPH组明显下调；而IPAH组miR-let-7i-5p明显上调，miR-320a明显下调。该研究表明miR-let-7i-5p作用的11个靶基因及miR-320a作用的20个靶基因，可能参与调节肺动脉外膜成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞增殖、血管收缩、炎症及DNA损伤，且两种miRNA的靶基因雄激素受体(AR)及蛋白激酶Cα(PRKCA)在癌症中均有所研究。APTE组miR-let-7i-5p上调，而CTEPH组下调，与已知的D-二聚体、C反应蛋白及心脏指数等一致，反映了随时间变化的异常血管重塑。在可能由于肺动脉外膜成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞的过度增殖与抗凋亡表型不平衡导致了二者差异的IPAH组与CTEPH组中，即let-7i-5p在前者上调，而在后者下调。miRNA-320a与miR-let-7b-5p联合临床特征有助于经时间变化的APTE与CTEPH以及不同表型的IPAH与CTEPH的鉴别诊断。

综上所述，miRNA早期诊断APE具备很高的价值。

4 miRNA-21、miRNA let-7b-5p与miRNA-106b-5p

Liang等[19]通过建立姜黄素处理的APE大鼠模型，经蛋白免疫印迹法(Western Blot)分析及RT-qPCR证实了APE组Sp1、miRNA-21、NF-κB下调以及磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)上调。病人研究表明，姜黄素可降低APE大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室收缩压(RVSP)、血栓体积及肺部炎性因子。双荧光素酶报告分析及染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析显示，Sp1可通过结合miR-21启动子增加miR-21表达，且PTEN为miR-21的靶点。此外，通过评估腺病毒注射APE大鼠发现了miR-21或Sp1下调以及PTEN上调可降低肺动脉平均压(mPAP)、右心室收缩压(RVSP)、肺湿重与干重比值(W/D)、血栓体积及肺部炎性因子，表明姜黄素通过下调Sp1降低miR-21的表达，从而上调PTEN并削弱NF-κB信号通路，抑制APE大鼠肺损伤和炎症。

Liu等[20]在体内及体外实验通过缺氧/复氧(H/R)模型，发现APE中miRNA let-7b-5p可在转录后水平上调应激相关内质网蛋白1(SERP1)参与内质网应激反应，促进细胞凋亡，而SERP1激活后可调节其伴侣蛋白SEC61B参与应答，SEC61B可介导未折叠蛋白GRP78、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)以及PERK-C/EBP同源蛋白(CHOP)通路的CHOP引发炎症反应与肺内皮细胞凋亡。该研究表明miRNA let-7b-5p可通过上调SERP1并调节其伴侣蛋白SEC61B介导的GRP78及PERK-CHOP通路的PERK与CHOP参与内质网应激，最终导致肺部细胞凋亡及炎症反应，参与了APE的发病过程。

Chen等[21]研究发现在APE小鼠体内及体外血小板源性生长因子(PDGF)诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中，miR-106b-5p下调，肿瘤细胞核NR4A3(NOR-1)及增殖细胞核抗原(PCNA)上调。在PASMCs中，PDGF可降低miR-106b-5p水平，并增强NOR-1/PCNA通路的表达；同时，也验证了NOR-1过表达可以逆转该miRNA对PDGF诱导的PASMCs增殖及迁移的抑制。该研究表明，miR-106b-5p可通过作用于NOR-1 mRNA 3′非翻译区降低其表达，逆转PDGF诱导的PASMCs增殖及迁移，改善肺血管重塑，降低APE 死亡率。

APE病人病情危重，漏诊率高，及时识别并给予有效诊治对改善预后非常关键。临床常用的D-二聚体及CTPA存在一定的局限性，而新型生物标志物miRNA则为APE早期诊治提供了突破性的进展，期待更多研究结果实现其真正地应用并指导临床实践。