基于网络药理学探讨加味导赤散治疗心脾积热证复发性口腔溃疡的活性成分及作用机制

张 鸽，胡 月，王倩倩，李艳青，郭洪波

复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer，ROU)又名复发性阿弗他溃疡(recurrent aphthous ulcer，RAU)，是一种好发于唇、舌、颊和软腭等部位的孤立的、圆形或椭圆形溃疡，常伴有自发性疼痛，易反复发作，病程有自限性，是口腔黏膜病中最常见的溃疡类疾病，患病率高，居口腔黏膜病之首位。发病机制可能与机体的免疫功能紊乱、口腔菌群失调、微量元素缺失、微循环障碍等有关，病因尚不十分明确[1]。复发性口腔溃疡包括起始、初级损伤反应、扩展损伤反应、溃疡形成和修复5个阶段，炎症反应贯穿整个过程。现代医学主要采用化学药物治疗，常用的药物有维生素类、免疫调节类以及局部使用消炎类、激素类、止痛类药物[2]，尚缺乏有效的根治方法。根据症状表现，中医将复发性口腔溃疡归属于口糜、口疮范围[3]，病因病机多为心火亢盛，火热郁炽血脉，局部血败肉腐，则为痈肿疮疡。郭洪波教授治疗复发性口腔溃疡心脾积热证时以加味导赤散，多年临证“验之事不忒”。导赤散出自宋代钱乙的《小儿药证直诀》，由生地黄、木通、甘草、淡竹叶组成，主治心胸烦热，口渴面赤，意欲饮冷，口舌生疮；或心热移于小肠、小便赤涩刺痛、舌红、脉数等心经火热证。用通草易关木通，再加生石膏而成，延续了导赤散利水而不伤阴，滋阴而不恋邪，既清热又养阴之药性，又增加了其清热泻火之力和敛疮之功。本方药仅5味，配伍严谨，在复发性口腔溃疡发病过程中给予了综合、针对性的治疗，与辛寒之石膏同用，使心脾热邪得寒而止。本研究将中医学、现代医学及生物信息学巧妙结合，旨在基于“心主血脉”“心部于表”及微循环障碍理论分析复发性口腔溃疡的病因病机。在此理论指导下，选用加味导赤散治疗本病，并从现代药理及分子生物学等角度探讨其作用机制，使用分子对接验证生地黄在改善微循环方面发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 加味导赤散化学成分的筛选 借助中药系统药理学技术平台(TCMSP)[4]收集加味导赤散中甘草、通草的化学成分，对化合物进行筛选[5]，以口服利用度(oral bio availability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件，在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[6]数据库收集淡竹叶、生地黄的化学成分，并以Score cutoff>20、P<0.05为筛选条件，文献检索石膏的化学成分，获得5种中药的化学成分。

1.2 加味导赤散活性成分及潜在靶点预测 通过TCMSP、BATMAN-TCM数据库及文献检索，获取加味导赤散(石膏、淡竹叶、通草、生地黄、炙甘草)活性成分的作用靶点，并使用UniProt数据库[7]对靶点名称进行转换和矫正。

1.3 复发性口腔溃疡疾病靶点预测 以“recurrent oral ulcer”为关键词，在GeneCards数据库进行检索，获取全部的复发性口腔溃疡疾病靶点。

1.4 加味导赤散治疗复发性口腔溃疡的靶点预测 使用Venny在线作图工具(维尼2.1.0)将加味导赤散靶点与复发性口腔溃疡作用靶点取交集得到加味导赤散治疗复发性口腔溃疡靶点。

1.5 构建中药-成分-靶点网络及拓扑属性分析 利用获取的交集靶点制作Network以及Type文件，并将准备好的文件导入Cytoscape 3.8.2软件制作中药-成分-靶点网络图，并利用工具分析网络属性，导出属性文件，进行拓扑属性分析，通过药物与化合物及化合物与靶点连接情况，筛选出加味导赤散治疗靶点作用于复发性口腔溃疡的关键化合物和靶点，同时结合现有报道文献进行分析。

1.6 构建蛋白相互作用(PPI)网络及拓扑属性分析 将获取的加味导赤散治疗复发性口腔溃疡的靶点上传至STRING数据库(https://string-db.org/)[8]，物种选择为“Homo sapiens(智人)”，并设置条件“minimum required interaction score=0.4”和“hided is connected nodes in the network”，随后导入输出文件，利用Cytoscape 3.8.2软件制作PPI网络图并进行拓扑网络分析，同时构建药物-化合物-靶点网络，并利用Network Analyzer进行拓扑分析。

1.7 基因本体(GO)富集与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 采用DAVID6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[9]对加味导赤散治疗靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，随后导出富集分析结果文件，利用R语言进行作图实现结果可视化。

1.8 分子对接 通过PubChem数据库[10]收集生地黄活性成分3D结构，筛选生地黄作用的基因靶点中与微循环相关靶点：内皮素-1(EDN1)、纤溶酶原激活剂(PLAT)、纤溶酶原(PLG)、整合素β-2(ITGB2)、蛋白激酶C-δ型(PRKCD)，并从PDB数据库[11]筛选其最佳蛋白的晶体结构(有配体、结构相对完整)分别为：与EDN1复合的人内皮素受体B型(5GLH)、双苯甲脒人双链组织型纤溶酶原活化剂复合物的催化结构域(1A5H)、重组纤溶酶原KRingle 1的结构和纤维蛋白结合位点(1PKR)、整合素β2亚基的PHE2和PHE3片段结构(2P28)、磷酸酪氨酸结合结构域(1YRK)。利用AutoDock Tolls 1.5.6软件进行分子对接，结合能(predicted binding affinity)越小则表明蛋白与配体对接活性越好，利用Pymol 2.3.0分别对结合能最低的对接模式进行可视化处理。

2 结 果

2.1 加味导赤散中活性成分及靶点的筛选 在TCMSP数据库中搜索加味导赤散各单味药，基于ADME参数OB≥30%、DL≥0.18的条件初步筛选出91个活性成分，其中甘草88个，通草3个，重复成分1个，在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库检索淡竹叶和生地黄，最终得到8个有效成分，其中淡竹叶4个，生地黄4个。文献检索得到石膏化学成分1个，综合两个数据库及文献检索，共得到加味导赤散活性成分99个。最后用UniProt数据库将TCMSP数据库中得到的靶点名转换为Gene symbol，得到5味药物的靶点，去除重复值后，得到426个药物靶点，包括甘草225个，地黄216个，石膏0个，淡竹叶7个，通草3个，其中25个重复靶点。

2.2 复发性口腔溃疡疾病靶点的获取 在GeneCards数据库中以“recurrent oral ulcer”为关键词，检索疾病靶点，并3次计算Relevance score值的中位数，选择大于中位数的疾病靶点，最终得到479个疾病靶点。

2.3 加味导赤散治疗复发性口腔溃疡的靶点预测 将药物靶点和疾病靶点列表分别放入维尼2.1.0得到疾病与药物的交集靶点，共93个交集。详见图1。

图1 疾病与药物的交集靶点Venn图

2.4 中药-成分-靶点网络构建及分析结果 通过Cytoscape 3.8.2来构建加味导赤散治疗复发性口腔溃疡的药物-成分-靶点网络图(见图 2)。图中菱形代表共同靶点，圆形代表药物及其有效活性成分，颜色越深，图形越大，代表度值(degree)越大，连线越粗，连接越紧密。结果显示，药物-化合物-靶点网络总共186个节点、791条边，包括90个化合物节点，93个靶点节点，其中3个单味药节点，依照交集结果，各单味药度值从大到小排名为甘草(84)、淡竹叶(3)、生地黄(3)、通草(0)、石膏(0)。排名前5位的化合物为槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、甘草查尔酮A(licochalcone a)、柚皮苷(naringenin)、异鼠李素(isorhamnetin)。详见表 1。网络图中度值排名前10位的靶点为前列素内环氧化物合成酶2(PTGS2)、雌激素受体(ESR1)、雄激素受体(AR)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)、凝血因子X(F10)、前列素内环氧化物合成酶2(PTGS1)、二肽基肽酶-4(DPP4)、血管内皮细胞生长因子受体2(KDR)。预测这些关键化合物和靶点在加味导赤散对复发性口腔溃疡的治疗调控网络中起着至关重要的作用。

图2 中药-成分-靶点网络图

表1 加味导赤散中主要有效化合物基本信息

2.5 PPI网络构建及关键靶点筛选 将加味导赤散的治疗靶点基因导入STRING数据库数据库，设置筛选条件为智人，设置条件“minimum required interaction score=0.9”和“hided is connected nodes in the network”，保存得到的相应结果文件，得出88个基因靶点，PPI网络如图 3所示，颜色越深，图形越大，degree值越高，筛选排名前10位的靶点分别为信号传导及转录激活因子3(STAT3)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素6(IL6)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、血管内皮生长因子-α(VEGFA)、 转录因子p65(RELA)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)1、表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素(INS)，提示这些靶点在加味导赤散治疗复发性口腔溃疡中可能具有重要作用。

图3 PPI网络图

2.6 GO富集分析结果 利用DAVID6.8进行GO分析，导出结果文件，并用R语言将结果可视化。结果得到GO生物学过程(biological process，BP)600个条目，前10个为生物学过程中RNA聚合酶Ⅱ的转录正调控、炎症反应、信号转导、对缺氧的反应、免疫反应、对药物的反应、积极调控细胞增殖、对脂多糖的反应、凋亡过程的负调控、转录的正调控，DNA模板。GO细胞组分(cellular component，CC)50个条目，前10个分别为细胞外空间、细胞质、质膜、细胞外区域、胞质溶胶、细胞外泌体、膜、线粒体、质膜的组成部分、细胞质的核周区域。GO分子功能(molecular function，MF)85个条目，前10个分别为蛋白质结合、相同的蛋白质结合、蛋白质均二聚活性、细胞因子活性、酶结合、血红素结合、蛋白质异二聚活性、锌离子结合、受体结合、转录因子结合。详见图 4～图 6。

图4 GO-BP富集分析结果

图5 GO-CC富集分析结果

图6 GO-MF富集分析结果

2.7 KEGG通路分析结果 KEGG通路富集分析发现93个共同靶点有92个(98.9%)被富集，共105个通路，前20条通路主要富集为：乙型肝炎、癌症的途径、膀胱癌、缺氧诱导因子1(HIF-1)、TNF信号通路、恰加斯病、胰腺癌、利什曼病、前列腺癌、蛋白聚糖在癌症中、疟疾、弓形体病、磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号通路、肺结核、细胞凋亡、炎症性肠病、小细胞肺癌、非酒精性脂肪肝、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路、类风湿性关节炎。利用R语言作图，详见图 7。

图7 KEGG富集分析结果

2.8 分子对接结果 结合能较低的6对是PLAT与campesterol、PLG与Gamma-Aminobutyric Acid、EDN1与campesterol、PRKCD与campesterol、PLG与campesterol、ITGB2与campesterol；用Pymol 2.3.0软件将分子对接可视化，最后两组最低结合能状态下无氢键形成。详见表2、图 8。

表2 生地黄有效成分-关键靶点分子对接结果

图8 分子对接模式及结果

3 讨 论

心主血脉，脉为血府，与心相连，在心气充沛，血液充盈，脉道通利的情况，心气才能推动血液畅行脉中，环周不休。心、血、脉三者的正常是保证血运畅通的条件。王丽丹等[12]经理论研究得出血与脉的生理和病理与心关系密切。徐吉利等[13]认为“心部于表”有两方面涵义：其一，心气的运动趋势是向上向外，故主体表；其二表为“阳”意时，“心部于表”是指心的生理特性即心属火、为阳中之阳脏。故而《外台秘要》云：“口疮者，心脾有热，气冲上焦，熏发口舌故作疮也。”吴以岭[14]认为，中医“络脉”在形态和功能上与现代医学的微血管和微循环相似，络病的病理变化涉及现代医学中血液流变学改变、局部微循环障碍、血流力学改变及细胞因子调控异常等。在复发性口腔溃疡发生发展过程中均不同程度上有血流动力学、血液流变学及微血管病变参与到微循环障碍的发生过程中，微循环障碍使局部组织细胞缺氧坏死，引起黏膜组织损伤，同时会使局部血管的通透性增加，导致免疫物质渗出而引起自身免疫反应。

从中药-成分-靶点网络图中得出，治疗复发性口腔溃疡的有效成分为槲皮素、山奈酚、甘草查尔酮A、柚皮苷、异鼠李素。基础实验验证，异鼠李素的消炎作用主要是抑制NF-κB途径[15]。炎症反应各个阶段的许多分子受NF-κB调节，包括TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)、IL6、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素12(IL-12)、诱导型一氧化氮合酶2(iNOS)、环氧化物酶2(COX2)、趋化因子、黏附分子、菌落刺激因素以及其他因素。另外，从体外研究和体内动物模型获得的结果表明，柚皮苷可以下调几种炎症性标志物的表达，如toll样受体4(TLR4)、TNF-α、IL-1β、IL6、iNOS，通过减弱NF-κB通路和激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)来激活COX2，这与多种促炎信号通路的抑制作用有关[16]。山奈酚通过抑制蛋白激酶和转录因子对炎症相关疾病(包括过敏、关节炎、糖尿病、心血管疾病、癌症和神经系统退化)具有治疗作用。山奈酚能够通过下调活性氧(ROS)依赖的MAPK-NF-κB和凋亡信号通路来减轻氧化应激和炎症反应[17]。槲皮素[18]可阻止巨噬细胞中细菌脂多糖引起的iNOS、IL-1β和TNF-α的分泌，RAW2647细胞中TNF-α的分泌，细胞因子刺激的血管细胞黏附分子1(VCAM-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达，以及人脐静脉内皮细胞中的E-选择。研究表明，甘草查尔酮A显著上调小鼠巨噬细胞RAW 2647细胞中抗氧化酶血红素氧合酶1(HO-1)和核因子红系2相关因子2(Nrf2)[19]。这种上调与Nrf2核易位的诱导、Keap1蛋白表达的降低和抗氧化反应元件(ARE)启动子活性的升高有关。由此可见，甘草的多种有效成分除消除炎症反应之外，还可从多方面改善复发性口腔溃疡病人的微循环障碍。且度值较高的靶点中凝血因子X(F10)、血管内皮细胞生长因子受体2(KDR)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)均为与微循环障碍相关的靶点，由此可知，加味导赤散治疗复发性口腔溃疡时对其血液、血管的病理状况可起到改善作用。

从PPI网络图分析得出，PTGS2和 PTGS1是炎性疾病的重要靶点，当机体受脂多糖、真菌病原体和TNF-α、IL-1β等促炎症因子刺激后，PTGS2和PTGS1的表达迅速增加，引起炎性反应，导致组织损伤。MAPK14参与机体的免疫调节与炎症反应，可以调控 TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子的基因表达。DPP4是一种细胞表面糖蛋白，通过调节T细胞活化、细胞因子的水平、T细胞依赖性抗体的生成和B细胞免疫球蛋白参与介导机体免疫功能和疾病的发病机制，在巨噬细胞介导的炎症、组织重塑和自身免疫性疾病中发挥重要作用。胰岛素可以通过增加角质形成细胞、内皮细胞和成纤维细胞的再上皮化、血管生成和细胞外基质分泌的速率来促进愈合。可以归因于胰岛素作为一种生长因子在愈合事件中的合成代谢作用。胰岛素作用于生长激素受体，增加人角质细胞的迁移、再上皮化以及胶原含量、肉芽组织和纤维母细胞局部胰岛素样生长因子的产生[20]。IL6是一种由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生的淋巴因子，能使B细胞前体成为产生抗体的细胞；与集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能；能被TNF-α、IL-1等诱导且是急性期反应的主要细胞因子。

GO生物学过程中炎症反应、信号转导、对缺氧的反应、免疫反应、对药物的反应、积极调控细胞增殖、对脂多糖的反应、凋亡过程的负调控等与加味导赤散治疗复发性口腔溃疡的机制密切相关，GO分子功能中血红素结合这一功能或可改善复发性口腔溃疡病人的微循环障碍。KEGG富集分析发现，与本研究密切相关的通路有HIF-1、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡、NF-κB信号通路等。何璐[21]经动物实验发现，模型组γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平都升高，加味导赤散高剂量组、中剂量组、低剂量组治疗后血清IFN-γ和IL-4水平均降低，其中以高剂量组IFN-γ降低水平最为明显。这一结果与GO富集分析研究高度吻合，由此可知，加味导赤散治疗复发性口腔溃疡或可通过改善细胞因子进一步影响微循环。

李玲[22]经临床实验发现复发性口腔溃疡病人红细胞聚集指数、全血切变率、全血低切相对指数、全血低切还原黏度较对照组呈上调表达，卡松黏度低于对照组，提示复发性口腔溃疡的发生与血流变指标异常导致的微循环障碍有关，并且指出了微循环障碍的主要因素是血流变红细胞聚集性的增加。现代药理研究发现，地黄根茎主要含β-谷甾醇与甘露醇，及少量豆甾醇、微量的菜油甾醇(Campesterol)，还含地黄素、生物碱、脂肪酸、梓醇与维生素A类物质，地黄乙醇提取物对麻醉动物有降低血压及促进血液凝固的作用[23]。从分子对接结果可知，菜油甾醇与这五种基因靶点结合均有最低结合能产生，且与PLAT的结合能最低，PLAT即纤溶酶原激活剂，通过水解纤溶酶原中的单个 Arg-Val键，将丰富但无活性的酶原纤溶酶原转化为纤溶酶。通过控制纤溶酶介导的蛋白水解，在组织重塑和降解、细胞迁移和许多其他病理生理事件中发挥重要作用。通草具有通利血脉、清热利尿的功效，现代基础药理研究利用二氯甲烷和甲醇对通草进行提取，结果表明，通草中80%的化合物和抗凝血酶Ⅲ类具有类似作用，从而表明通草具有预防血栓的作用[25]。

综上所述，加味导赤散治疗复发性口腔溃疡是多种成分作用于多靶点、多通路，其中多个靶点及通路均涉及“络病”的病理变化。本研究证实，生地黄、通草、甘草等的有效成分可明显改善微循环障碍，这与微循环障碍多因素相互交错重叠的机制相契合，也表明了“心主血脉”“心部于表”及“络病学”理论指导临床用药之意义重大，值得进一步实验验证。