肿瘤心脏病学动物模型的研究进展

张 钰孟婷婷田 鹏郑 燕*苏国海*

(1.山东大学,济南 250013;2.济南市中心医院,济南 250013;3.专科转化研究中心,山东第一医科大学附属中心医院,济南 250013)

随着抗肿瘤药物的不断更新,抗肿瘤疗效显著提高,肿瘤患者的病情得到好转,但随之而来的肿瘤本身对心功能的影响及抗肿瘤药物相关心血管毒性却成为肿瘤病人死亡的另一重要原因。 在此背景下,作为研究肿瘤学和心血管病学的新型交叉学科,肿瘤心脏病学(cardio-oncology)应运而生[1]。

抗肿瘤治疗过程中引起的心血管毒性是肿瘤心脏病学的主要研究内容之一。 已有报道,传统的化疗药,靶向药、免疫检查点抑制剂和放疗等都可能会引起潜在危及生命的心血管并发症,包括心力衰竭、高血压、心律失常、心肌炎和心肌缺血等[1]。对其发病机制及保护性药物的研究引起越来越多的重视,正逐渐成为该领域的研究热点。 动物模型在其中的作用不容忽视,当前大部分体内实验采用了啮齿类动物构建肿瘤心脏病学模型。 然而,不同的研究中所选用的实验动物品系,药物剂量和评价指标存在较大差异[2]。 建立贴近于临床的肿瘤心脏病学动物模型,对研究抗肿瘤过程中发生心血管毒性的分子机制,寻找理想的生物标志物意义重大,可帮助医生制定合理的诊疗方案以预防和及时治疗心血管并发症。 本文对当前已发表的肿瘤心脏病学动物模型进行综述,分析其特点,助力研究者构建合适的肿瘤心脏病学动物模型。

1 蒽环类药物动物模型

蒽环类药物是治疗乳腺癌、淋巴瘤、白血病的一线用药,应用较广泛,包括阿霉素(doxorubicin,DOX)、柔红霉素、表柔比星等。 蒽环类药物引起心血管毒性发病率较高且随着累积用药剂量的增大,心脏毒性的风险增高,是最早引起学者关注的产生心脏毒性的抗肿瘤药[3]。 当前研究发现蒽环类药物激发心脏毒性的机制有以下途径:活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生、钙超载、脂质过氧化和线粒体功能障碍等。 相关研究的体内实验多采用小鼠、大鼠模型,根据研究目的分为急性损伤模型和慢性损伤模型。

1.1 小鼠模型

由于存在遗传背景清晰,操作方便,所采集的数据指标便于分析等有利因素,小鼠模型在肿瘤心脏病学研究中最为常用。 当前大部分研究蒽环类药物动物模型采用C57BL/6 小鼠,以腹腔注射方式给药。

1.1.1 非荷瘤小鼠模型

急性损伤模型为短期内大剂量给药:累积剂量20～30 mg/kg 的阿霉素[4-6],在用药后第1～2 周超声显示射血分数比对照组下降15%～30%,组织学检查发现心肌细胞间有大量炎性细胞浸润。

慢性损伤模型的给药方案在不同课题组差异较大:给药时间大约为2～12 周,累积剂量18～36 mg/kg 不等[7-12]。 观测时间点差异也较大(4～13周),这与给药方案及检测手段的不同有关,实验结果超声示左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS) 比对照组下降10% ～20%,心肌坏死标志物升高等表现。 较温和的给药方案如3 mg/kg,每周1 次,持续12 周;与5 mg/kg,每周1 次,持续4 周相比,其监测心脏毒性的时间点较长(12 周 vs.4 周);同样Noel 等[8]采用每周注射3 mg/kg 的用药方案,心脏磁共振(cardiac magnetic resonance imaging,CMR)在第4 周发现异常,有明显的细胞外体积分数(extracellular volume fraction,ECV)增加,整体纵向应变(global longitudinal strain,GLS)恶化,而另一课题组超声在第12 周监测到心脏损伤,提示采用磁共振可更早监测到心脏损伤[11]。

比较不同课题组采取相同的给药方式得出的结果发现[7,9],以5 mg/kg 的剂量,每周给药1 次,累积20 mg/kg 的用药方案,可在第4 周超声检测到心脏损伤,能获得较稳定的肿瘤心脏病动物模型,降低小鼠死亡率,缩短模型建立时间。

虽然是同种系小鼠,但在不同研究中存在周龄、体重不同,及实验室饲养条件等差异,导致小鼠对药物的耐受性不同,所以需要更多的研究探索,尽可能控制各项可变因素,以建立合适的建模方案。

1.1.2 荷瘤小鼠模型

荷瘤鼠模型较非荷瘤鼠模型能够更好地模拟肿瘤患者的真实情况,可同时观察化疗药对肿瘤的治疗效果及对心血管的影响。 然而由于操作较复杂,当前检索到6 篇蒽环类药物的荷瘤鼠模型,其中有5 篇乳腺癌模型[13-16],1 篇为肉瘤模型[17]。

乳腺癌模型中,多数报道选择同种鼠源4T1 乳腺癌细胞,BALB/c 小鼠乳腺脂肪垫原位或皮下成瘤,其中两项研究采用10 mg/kg 大剂量短时间给药,累积20～30 mg/kg,在第2～3 周出现心肌损伤[14,16];另一项研究采用4 mg/kg,每周给药1 次,持续3 周,在第6 周检测到心肌损伤[15]。

采用C57BL/6 小鼠,E0771 乳腺癌细胞成瘤,成瘤后腹腔注射阿霉素5 mg/kg,每周给药1 次,持续3 周,于第3～4 周检测到心脏损伤[16]。 与非荷瘤C57BL/6 小鼠模型相比,荷瘤鼠心肌损伤出现的时间较早。

另有一项报道中,为研究人源乳腺癌,将人乳腺癌细胞TB474 接种于免疫缺陷BALB/c 小鼠建模[13],成瘤后DOX 5 mg/kg,每周给药1 次,累积剂量40 mg/kg,于第16 周检测到心脏损伤。

肉瘤模型为KM 鼠,采用鼠源S180 肉瘤细胞,皮下成瘤,每 d 给药2 mg/kg,,持续10 d,成功建立急性心脏损伤模型[17]。

以上荷瘤鼠动物模型首先要成瘤,然后给予抗肿瘤药,可观察药物对肿瘤和心血管的作用,对于同时研究抗癌作用和心脏保护治疗提供了较为适宜的模型手段。 但由于当前报道较少,尚需要进行更多的探索,以寻找合适的建模方案(见表1)。

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表1 蒽环类小鼠动物模型Table 1Anthraceneclinemouse animal model

1.2 大鼠模型

与小鼠相比,大鼠体积大,影像学观察更为清楚,解剖操作方便直观,存活率也较高。 同样,由于操作简便,大鼠的非荷瘤模型较荷瘤模型应用广泛。 Wistar 大鼠,SD 大鼠和Fischer(F344)大鼠均有应用,其中Wistar 大鼠使用较多(见表2)。

用药方案多采用每隔1～3 d 腹腔注射1 次,累积9～18 mg/kg,心肌损伤指标的检测时间在第13～14 天[18-22]。 Sergazy 等[22]采用单次大剂量(8 mg/kg)注射后第8 天检测到心肌损伤血清标志物的异常。

有两项研究采用尾静脉注射的给药方式:小剂量多次给药(1.5 mg/kg,累积9 mg/kg)于第51 天检测到LVEF 降低[19]。 单次尾静脉注射阿霉素5 mg/kg,第70 天超声出现肥厚型心肌病和扩张型心肌病两种变化[20]。 提示蒽环类药的慢性心脏毒性不容忽视。

Todorova 课题组的研究中构建了大鼠荷瘤模型:Fischer(F344)大鼠同种乳腺癌MatBIII 细胞,乳腺脂肪垫接种成瘤。 急性损伤模型采用单次腹腔给药12 mg/kg,3 d 后观察到出现急性心脏损伤[23];慢性损伤模型腹腔注射2 mg/kg,1 周2 次,累积12 mg/kg,于3 周后检测到心脏功能及心肌细胞毒性改变[24]。

总的来说,当前蒽环类肿瘤心脏病学动物模型研究较多,但仍需在不同课题组间进行比较,寻找稳定统一的建模方案,以利于课题组间进行研究结果的比较(见表2)。

表2 蒽环类大鼠动物模型Table 2 anthracycline rat model

2 免疫抑制剂类动物模型

最近几年临床病例显示,免疫检查点抑制剂(checkpoint inhibitors,ICIs)能够有效的提高晚期肿瘤患者的生存率。 然而免疫抑制疗法的心血管损伤也不容忽视,其中最显著的损伤就是急性心肌炎[25],对其机制的研究引起了学者的广泛关注。Tay[26]等 和Liu 等[27]的研究中采用了荷瘤小鼠模型,分别皮下注射黑色素瘤细胞和结肠癌肺转移细胞建立荷瘤模型,腹腔注射给药,PD-L1 抗体每只100～150 μg,PD-1 抗体每只200～250 μg,在第1 d天观察到心肌标志物的异常升高,成功构建肿瘤心脏病动物模型。 Michel 等[28]为了研究抗PD-1 疗法在治疗黑色素瘤中的心脏毒性作用,每隔1 d 腹腔注射250 mg PD-1 抗体,注射6 次后检测到小鼠LVEF 下降,整体径向应变下降51%。 在非荷瘤鼠模型的构建中,陈振寅等[29]综合考量小鼠的存活率和临床患者的用药剂量分析,实验得出最适宜的建模方案为尾静脉注射抗PD-L1 10 mg/kg 或抗PD-1 12.5 mg/kg ,每周1 次,在第4 周超声示LVEF,LVFS 下降,诱发心血管损伤。 也有课题组在第1 天和第14 天分别腹腔注射PD-1 抗体5 mg/kg,在第28 天超声观察到LVEF 和LVFS 下降[30-31]。

3 抗血管生成靶向药物类动物模型

新生血管的生成在肿瘤的生长和扩散起着至关重要的作用,因此血管生成抑制剂在抗肿瘤治疗中应用较为广泛。

研究报道此类的抗肿瘤药可以诱发心力衰竭,高血压,QT 间期延长和室性心律失常[32]。 当前研究主要针对血管生成抑制剂舒尼替尼和大分子单抗靶向药贝伐单抗展开,均采用小鼠非荷瘤模型:舒尼替尼25～50 mg/kg,每天灌胃给药持续2～6周[33-36]。 贝伐单抗每周静脉给药10 mg/kg,累积剂量20～40 mg/kg[35-36]。 小鼠模型出现心脏毒性的最早时间在用药后的第2 周,表现为超声显示LVEF下降,血清肌钙蛋白水平增高,血压增高等变化。

4 抗HER-2 单克隆抗体类动物模型

单克隆抗体曲妥珠(赫赛汀)靶向抑制HER-2蛋白,在HER-2 过表达的乳腺癌、胃癌等的治疗中较多应用,其心脏毒性的发病率在1.7%～20%。 曲妥珠单抗诱导心脏毒性的小鼠模型中,多采用腹腔注射3～10 mg/kg 的曲妥珠,累积剂量9～20 mg/kg,连续的超声检测,最早在第10 天可观察到左室舒张末期内径增加, 射血分数下降到 40%[37-40]。Olorundare 等[41]和Beiranvand 等[42]研究中采用大鼠模型,腹腔注射曲妥珠单抗的用量为2.25 ～20 mg/kg,累积剂量在15.75～60 mg/kg 范围内,在第7 天出现血清LDH 和肌钙蛋白水平增高,心肌组织检测能看到有明显的血管充血和冠状动脉微血栓的形成。

5 其他化疗药动物模型

肿瘤治疗中,各种化疗药的应用在杀伤肿瘤细胞的同时也会损伤正常组织,心肌损伤是常见的副作用之一。 多篇研究中构建了顺铂急性心脏毒性大鼠模型:腹腔注射单剂量顺铂7 mg/kg,第5 天与对照组比较可观察到心肌标志物升高,氧化应激标志物明显增加,提示出现心肌损害[43-45]。 Zhao等[46]用小鼠建立慢性模型,腹腔注射3～6 mg/kg 的顺铂,每周1 次,累积剂量为9 或18 mg/kg,于第24天发现3 mg/(kg·d)的小鼠心肌未见明显改变,而6 mg/(kg·d)的小鼠超声发现有收缩和舒张功能受损。

烷基化剂环磷酰胺也是常用的化疗药物,临床研究发现,可诱发心肌病,心包炎甚至充血性心衰。Senthilkumar 等[47]和Viswanatha 等[48]均采用雄性Wistar 大鼠建模,分别腹腔注射150 或200 mg/kg环磷酰胺,于用药的第10、12 天检测到血清学心肌损伤指标出现异常。

以上传统化疗药及靶向药物在临床上引起心脏毒性的概率较蒽环类药物低,动物模型的研究相对较少。 需要结合临床发病情况,包括发病患者的基础疾病、用药方案等,归纳其中的规律,寻找可能的影响因素。 在动物实验中对各种影响因素进行考量,进行更加细致的研究探索才能建立较稳定的肿瘤心脏病模型。

6 放疗动物模型

放射治疗在晚期乳腺癌和一些胸部肿瘤中起到不可或缺的作用,然而超过一半的患者会发生辐射诱发的心脏功能障碍包括心包炎、缺血性心脏病、心肌纤维化,及心脏瓣膜异常 。 放疗模型一般选用啮齿类动物,10～12 周的成年雌性大鼠接受单剂量24 Gy 心脏辐射治疗,CMR 检测发现在放疗后10 周出现心肌应变恶化,心肌水肿[49]。 Lee 等[50]采用小鼠连续5 d 接受每日2 Gy 的照射,10 Gy 为1个疗程,5 个疗程,总累积剂量为50 Gy,在照射后的18 个月小鼠心脏组织学显示心肌纤维化。

7 小结与展望

肿瘤心脏病学作为新型交叉学科,近年来受到越来越多心血管和肿瘤学专家的关注,但学科发展仍处于起步阶段,相关动物模型的研究尚存在较多问题,不同研究团队采用的建模方式差异较大,不利于课题组间研究结果的相互比较。

当前最常见肿瘤心脏病学动物模型为啮齿类动物模型,但大部分研究采用的非荷瘤鼠建模,虽然取得了一定的研究成果,但与荷瘤鼠模型相比,后者具有以下优势:更能真实反映临床患者体内的情况;荷瘤鼠模型考虑了肿瘤本身对心脏的影响和抗肿瘤药代谢的影响,可同时评估药物的抗肿瘤和心血管毒性作用,精确反映抗肿瘤药在体内的作用及分子机制;更有助于寻找理想的心血管保护药物:具有心血管保护作用的同时与抗肿瘤药物无拮抗作用。

啮齿类肿瘤心脏病学动物模型也存在部分不足:(1)动物心脏的重量、心肌结构、心率、心肌离子通道的状态等方面与人类相比仍然有较大的差异。心血管表型的严重程度可能根据所使用的动物品系的遗传背景不同而不同,同样动物模型和人类患者的临床观察之间仍可能存在平移差距,例如,伊马替尼在啮齿类动物中引起心肌病,但在患者中似乎没有同样的效果。 未来可采用猪、猴等大型实验动物来弥补这一不足。 (2)人类的一些基础性疾病如高血压,糖尿病等尚未在动物模型中有很好的体现。 可在建立稳定的荷瘤鼠心脏病模型的基础上,进一步引入以上基础性疾病,建立更精细的动物模型。 同时在抗肿瘤药的给药方式、剂量,成瘤部位,心脏保护药物的给药时间点等方面进行细致考量。

总之,对于新兴学科肿瘤心脏病学,未来发展潜力巨大,但由于相关研究相对较少,加之存在肿瘤、抗肿瘤方案、患者的基础疾病等的复杂多样的影响因素,建立稳定可靠的动物模型是任重而道远,随着各种实验技术的发展和检测水平的提高,相信肿瘤心脏病学的动物模型将会更加完善,更贴切地模拟临床特征。