色胺酮对小鼠血小板扩展和粘附及斑块回缩的作用*

田晓云， 袁兆伟， 郭芳， 熊秀琴， 任天和， 刘刚， 罗俊*

(贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室， 贵州 贵阳 550025)

目前，心血管疾病是影响人类健康的重要因素，加强心血管疾病的防治是当前的重中之重[1]。血小板数目异常或功能紊乱可造成出血性疾病或血栓性疾病，其中血栓性疾病大部分是由血小板异常活化引起动脉血栓所造成，给予抗血小板治疗后其发生率显著下降[2-3]。血小板是一种无核血细胞，由骨髓中成熟的巨核细胞分化而来，正常数量为(100～300)×109个/L，存活时间为7～9 d[4]。当血管受损时，暴露的胶原和血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)使血小板在损伤部位发生聚集活化，经“由内向外”信号引起血小板表面整合素αⅡbβ3的构型发生改变[5-7]。此时，整合素αⅡbβ3会与vWF结合，使血小板粘附于损伤部位[8]，通过整合素αⅡbβ3来介导“由外向内”的信号，引起血小板扩展和斑块回缩，最终产生稳定的血栓[9-10]。色胺酮的化学名为吲哚并(2,1-B)喹唑啉-6,12-二酮，呈弱碱性，属于吲哚喹啉类生物碱，主要存在于马蓝(如南板蓝根)、蓼蓝(如何首乌)及菘蓝(如北板蓝根)等产蓝植物中[11]。已有研究表明，色胺酮及其衍生物在抗菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤及抑制血管生成等方面有一定的作用[12-18]，但在抗血小板方面的研究尚未可知。因此，本研究旨在通过研究色胺酮对血小板扩展、粘附及斑块回缩的影响，为中药的开发利用和抗血小板新药的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 昆明种小鼠，体质量18～24 g，雌雄各半，由学校实验动物中心提供[SCXK(黔)2018-0001]，研究获学校伦理委员会批准(2000082)；实验前动物适应性喂养1周，提供充足的食物和饮用水。

1.1.2主要试剂和仪器 色胺酮(纯度97%；上海毕得医药)，胶原(美国Chrono-Log)，凝血酶、纤维蛋白原、前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-鬼笔环肽(美国Sigma)；Model 700型号血小板聚集仪(美国Chrono-Log)，BC-5130全自动血液细胞分析仪(深圳Mindray)，5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf)，DM4000B荧光显微镜(美国Leica)。

1.2 实验方法

1.2.1洗涤血小板制备 0.4%戊巴比妥钠麻醉小鼠(100 μL/10 g)，固定，使用含有1 ∶9(V/V)酸性柠檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose，ACD)的注射器从小鼠下腔静脉中抽血，以1 ∶1加Tyrode缓冲液，再加50 μg/L PGE1和10 U/L Apyrase，1 372 r/min离心10 min，弃下层部分；上清液2 567 r/min离心10 min，底部沉淀团块即为浓缩的血小板；沉淀的血小板用台式缓冲液重悬，加50 μg/L PGE1、10 U/L Apyrase及1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，2 567 r/min离心10 min，重复上述操作1次，重悬于1×Tyrode缓冲液中，即获洗涤血小板；采用全自动血液细胞分析仪计数将获得的血小板浓度调整为300×109个/L，实验过程均在室温下进行。

1.2.2血小板扩展和粘附功能 玻片放入24孔板，加25 mg/L纤维蛋白原溶液或200 mg/L胶原溶液，4 ℃包被过夜，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤；5×109个/L洗涤血小板250 μL加入离心管，分为空白组(不做任何处理)、对照组(1‰ DMSO)、色胺酮组(10 μmol/L色胺酮)及阳性药组(0.5 mg/L替罗非班)，37 ℃孵育10 min；除空白组外，取1 mmol/L CaCl22.5 μL和1 mmol/L MnCl22.5 μL加入各管中，混匀转移至孔板，37 ℃ CO2培养箱内扩展60 min，弃上清，PBS洗涤；加4%多聚甲醛溶液，常温静置15 min，弃上清，PBS洗涤；加0.1%Triton，膜穿孔60 min，弃上清，PBS洗涤；避光加1 mg/L FITC-Phalloidin进行染色，暗室静置60 min，弃上清，PBS洗涤；固定于载玻片后，荧光显微镜下观察血小板的扩展或粘附情况，拍照保存；使用ImageJ软件评估各组单个血小板的扩散面积和粘附数目。

1.2.3血小板斑块回缩实验 调整洗涤血小板数目为200×109个/L，聚集杯中加悬液500 μL，分为空白组(不做任何处理)、对照组(1‰ DMSO溶剂)、色胺酮低剂量组(5 μmol/L色胺酮)、色胺酮高剂量组(10 μmol/L 色胺酮)及阳性药组(0.5 mg/L替罗非班)，37 ℃预孵育10 min；各管分别加1 mmol/L Ca2+和400 mg/L纤维蛋白原，上下颠倒混匀；除空白组外，每管各加200 U/L凝血酶5 μL，上下颠倒混匀，37 ℃观察斑块回缩，于30 min时进行观察和拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血小板扩展功能

在纤维蛋白原表面上进行扩展后，与空白组相比，对照组小鼠血小板单个平均扩展面积增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与对照组相比，色胺酮组和阳性药组小鼠血小板单个平均扩展面积减少，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01，图1)。

注：A为血小板扩展的FITC-鬼笔环肽染色结果(1 000×)；B为血小板扩展的定量结果；图中红色箭头表示血小板完全扩展状态，绿色荧光表示血小板细胞骨架；(1)与空白组相比，P<0.01；与对照组相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01。图1 各组小鼠血小板在固化纤维蛋白原表面的扩展能力Fig.1 Spreading ability of the mouse platelets on the surface of solidified fibrinogen in each group

2.2 血小板粘附功能

在胶原表面上粘附后，与空白组相比，对照组和阳性药组小鼠血小板的粘附数目增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，色胺酮组小鼠血小板的粘附数目减少，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.3 斑块回缩

体外斑块回缩实验结果显示，与对照组相比，色胺酮低、高剂量组小鼠血小板斑块回缩程度被抑制，阳性药组小鼠血小板未见斑块回缩(图3)。

3 讨论

血栓形成和血栓栓塞均会引起血栓性疾病，血小板的异常活化是引起血栓栓塞的主要原因[19]。现有的抗血小板药物(例如阿司匹林)具有不同程度的副作用(例如肠道出血)，严重时可造成死亡[3]。本研究探讨了色胺酮对血小板粘附和扩展功能及体外血栓形成的影响，结果表明色胺酮可抑制血小板在纤维蛋白原表面的单个扩展面积、在胶原表面的粘附数目及体外血栓的形成。

注：A为血小板粘附的FITC-鬼笔环肽染色结果(400×)；B为血小板粘附数目的定量结果；(1)与空白组相比，P<0.05；(2)与对照组相比， P<0.05。图2 各组小鼠血小板在固化胶原表面的粘附能力Fig.2 Adhesion ability of mouse platelets on the surface of solidified collagen in each group

空白组 对照组 色胺酮低剂量组 色胺酮高剂量组 阳性药组图3 各组小鼠血小板的斑块回缩实验结果Fig.3 Clot retraction test results of mouse platelet in each group

当血小板与内皮破损处接触时，血小板胞质内的颗粒会迅速向中央聚集，胞膜向外伸出伪足，形成树突型血小板，这个过程即为血小板的扩展[20]。本研究通过观察血小板在固化纤维蛋白原上的扩展情况，从而探究色胺酮对血小板扩展功能的影响。血小板的粘附功能是指血管内皮受损后，血小板在血液循环中可粘附在血管内皮上，或在体外可粘附于玻璃表面，从而起到局部止血的作用[21]。为进一步研究色胺酮对血小板粘附功能的影响，检测了血小板在固化胶原上的粘附实验。血小板的扩展和粘附是动脉血栓形成过程中的重要环节，当血管内皮细胞受损时，胶原和vWF等基底物暴露后，血小板可以通过其表面受体粘附到受损部位，同时，活化的血小板收缩后被纤维蛋白网罗，这是血栓形成和维持稳定的基本步骤[22-23]。本研究结果显示，色胺酮可以明显抑制血小板在纤维蛋白原上的扩展面积和在胶原上的粘附数目，表明色胺酮可能影响血栓的形成和稳定性。

整合素αIIbβ3是血小板膜上最丰富的糖蛋白受体，在血小板“由内向外”和“由外向内”的双向信号转导中起着介导作用[24]。在血小板止血和血栓形成过程中，同样发挥着重要作用[25]。活化的整合素与纤维蛋白原结合后会触发“由外向内”的信号传导，激活细胞内多种信号通路以介导血小板发挥功能。斑块回缩和血小板扩展是反映血小板“由外向内”信号传导的2个基本特征，其中斑块回缩也是表现血小板体外血栓形成的判断依据[26]。有趣的是，与抑制血小板扩展的结果一致，色胺酮也抑制了斑块回缩现象。表明色胺酮会抑制血小板整合素介导的“由外向内”的信号转导。

综上，色胺酮是通过抑制整合素αIIbβ3介导的“由外向内”的信号转导，从而发挥抑制血栓的形成和稳定性，但其作用机制和毒理性还有待进一步研究。