柑桔几丁质酶基因家族的结构、分类与进化分析

胡亚平，郭雁君，吉前华，蒋 惠，杨凤梅，郭丽英

(肇庆学院果树研究所/肇庆学院生命科学学院，广东肇庆，526061)

几丁质(Chitin)又称甲壳素，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4糖苷键连接而成的线性多糖，是细菌、真菌、线虫、甲壳动物、昆虫等物种外壳细胞壁的主要成分[1]。植物在受到真菌等病原侵袭时，其几丁质酶基因被诱导大量表达，产生的几丁质酶可将真菌等病原的细胞壁几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖，破坏病原的细胞壁，拮抗侵染[2]。电镜观察结果显示，几丁质酶常作用于菌丝顶端新合成的几丁质壁，使顶端壁合成中的代谢平衡被破坏，使顶端膨胀并融解，从而达到抑菌效果[3]。几丁质酶被用作基因工程提高植物抗病能力的靶标，通过转入外源几丁质酶基因、提高内源几丁质酶表达水平、改造植物原有的几丁质酶基因或将几丁质酶基因与其他基因联合表达，都有成功提高植物抗病能力的报道[4-18]。将柑桔的几丁质酶基因进行整理、归类和分析，了解每个基因的特性，清楚其作用，对利用几丁质酶基因提高柑桔抗病能力、提高柑桔产量和品质有积极作用。

1 材料与方法

1.1 蛋白质生物基本信息分析在华中农业大学公布的柑桔基因组数据网站(http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)上检索关键词“Chitinase”，获得柑桔的32个几丁质酶基因的DNA序列、蛋白质序列、染色体位置、内含子和外显子等信息。使用Vector NTI 11.5软件对信息进行整合，并分析这些基因的分子量、等电点等。

1.2 信号肽、细胞定位分析信号肽是引导新合成的蛋白质跨膜转移(或定位)的氨基酸序列，长度5～30个氨基酸残基，通常位于N-末端。使用SignalP 4.1和phobius两种软件预测信号肽，使用phobius和TMHMM软件可对蛋白在细胞中的定位进行分析。

1.3 保守结构域分析保守结构域是指在生物进化或者一个蛋白家族中具有不变或相同的结构域，他们一般具有重要的功能，不能被改变。采用NCBI网站上的Conserved Domain Search软件对柑桔几丁质酶蛋白进行保守结构域分析。

1.4 构建系统发育树使用Vector NTI 11.5软件，选取最大似然法得到柑桔几丁质酶基因家族的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 柑桔几丁质酶基因家族在柑桔染色体上的位置分布基于全基因组序列，共获得32个几丁质酶基因成员。有26个基因分布在柑桔染色体1、4、5、7、8、9上，在4、5、7、8染色体上部分基因成簇排列、彼此距离非常接近；其余6个成员(编号以orange1.1t开头的基因)未能定位于染色体上(见表1)。

2.2 柑桔几丁质酶基因家族的长度和分子量32个柑桔几丁质酶基因所编码蛋白质的分子量在14 851.52～72 736.09 Da之间。其中，orange1.1t00476.1编码蛋白分子量最大，长达636 个氨基酸(aa)；Cs5g21860.1编码蛋白等电点(9.15)是所有几丁质酶中最高的。Cs5g21890.1编码蛋白分子量最小，仅134 个aa，其等电点也是最小的，仅为4.53(见表1)。

表1 柑桔几丁质酶基因家族的特征

2.3 柑桔几丁质酶基因家族的信号肽及细胞学定位使用SignalP，Phobius和TMHMM 3种软件分析柑桔几丁质酶家族蛋白的信号肽以及细胞定位，由此可以将它们分为4种类型。23个几丁质酶属于第1种类型(图1A、B、C)：有信号肽且定位在细胞外，说明这些蛋白在信号肽的介导下输出到细胞外执行生物功能。6个几丁质酶属于第2种类型(图1D、E、F)：有信号肽，是跨膜蛋白，大部分位于细胞外，中间有一小段跨膜区域，C端位于细胞内。2个几丁质酶属于第3种类型(图1G、H、I)：无信号肽，定位在细胞外。1个几丁质酶(orange1.1t00476.1)属于第4种类型(图1J、K、L)：无信号肽，是跨膜蛋白。

注：使用Phobius(图A、D、G、J)，TMHMM(图B、E、H、K)和SignalP(图C、F、I、L)三种软件对几丁质酶家族蛋白进行分析的结果。图A、B、C以Cs1g26330.1为例，图D、E、F 以Cs5g21890.1为例，图G、H、I 以Cs4g01410.2为例，图J、K、L是orange1.1t00476.1。

2.4 柑桔几丁质酶家族基因在不同组织中的转录水平在柑桔转录组数据库中检索转录组测序的数据，可以得到每个基因的相对表达量。在叶子中，基因Cs5g24680.1相对表达量最高，其次是orange1.1t05124.1、Cs9g18700.1、Cs8g01810.1和Cs8g01810.2，其他的基因相对表达量较少；在果实中，基因cs5g24680.1相对表达量最高，其他的基因相对表达量都较低；在愈伤组织中，基因Cs9g18700.1相对表达量最高，其次是Cs5g24680.1，Cs5g21860.1 、Cs9g14710.1等基因，其他基因的相对表达量较低；在花朵中，基因Cs8g01840.1的相对表达量最高，其次是cs5g24680.1，Cs8g01810.1、Cs8g01810.2、orange1.1t05124.1，Cs8g01850.1，其他基因相对表达较低(见表2)。

表2 柑桔几丁质酶的家族基因在植物愈伤组织、花、叶、果实中的转录水平(相对表达量)

2.5 柑桔几丁质酶家族基因保守结构域和系统发育树将这些几丁质酶的蛋白序列用最大似然法构建系统发育树，结果如图2A所示。用NCBI Conserved Domain Search分析这32个基因的结构域，并将它们放在一起进行比较，结果见图2B所示。将基因信号肽、细胞学定位分析的结果做成简图，结果如图2C所示。综合三者的分析结果，可以将32个柑桔几丁质酶分为4类。

第Ⅰ类(图2A蓝色线条，5个)：都含有GH18几丁质酶结构域，同时具有糖基水解酶的功能(图2B)，都含信号肽且定位在细胞外(图2C)。

第Ⅱ类(图2A绿色线条，10个)：都含有GH18几丁质酶结构域，同时具有糖基水解酶的功能，大部分基因除此之外还含有一个丝氨酸/苏氨酸激酶的结构域(图2B)，多数是含有信号肽的跨膜蛋白(图2C)。

第III类(图2A红色，16个)：都含有GH19几丁质酶结构域，它同时具有溶菌酶的活性，部分基因还含有几丁质结合域(图2B)，都有信号肽且定位在细胞外(图2C)。

第IV类(图2A黑色，1个)：含有GH18几丁质酶结构域，同时具有糖基水解酶的功能，此外还含有一个PPR重复，是抗病蛋白中一个常见的结构域，功能未知(图2B)，是个无信号肽的跨膜蛋白(图2C)。

注：图左是基于基因编码蛋白序列构建的系统发育树，中间是对应基因的保守结构域简图，图右是这些基因编码的信号肽和细胞定位，左侧箭头代表有信号肽，中间箭头代表定位在细胞外部分，右侧箭头代表定位在细胞内的部分。

3 讨论

植物几丁质酶结构可以分为N-端信号肽区、主结构区(催化区)和C-端延伸区三部分，有的在N-端信号区之后有富含半胱氨酸的几丁质结合域，它与主结构区之间有一段可变交联区。本研究发现，柑桔几丁质酶家族全部带有催化功能区，该区主要负责催化功能，切断几丁质以达到抗病作用；其中，第Ⅰ、Ⅱ、IV类柑桔几丁质酶含有GH18几丁质酶结构域，含有GH18结构域的几丁质酶广泛存在于病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物中，其主要功能是分解周围环境中的几丁质，以满足其自身对营养的需求，而对真菌的抑制能力较弱；第III类柑桔几丁质酶含GH19几丁质酶结构域，含GH19结构域的几丁质酶主要存在于植物中，有糖基化水解酶功能，其功能主要是抑制病原真菌的生长，进行自我防御，可能在植物抗病过程中具有较为重要的功能[19]。

不同类型的几丁质酶及其在细胞中定位的不同，使其在抗真菌中的作用也不同[1，20]。体外抑菌试验中，碱性几丁质酶具有最高抗菌活性，而其他的几丁质酶则几乎无抑菌活性。本研究对柑桔几丁质酶等电点进行分析显示(表1)，等电点大于8的几丁质酶有11个，可能具有较高的抗菌活性。多数细菌的几丁质酶等电点为酸性，放线菌的几丁质酶等电点一般为中性或碱性，而植物的几丁质酶等电点往往为较强酸性或较强碱性[19]。柑桔[15]绝大多数几丁质酶(26个)带有信号肽(长度在20～30氨基酸残基)，表明这部分酶是在信号肽介导下输出到细胞外发挥作用；部分酶(7个)带有C端延伸区，以跨膜蛋白形式存在。在植物体内，细胞间隙定位的几丁质酶被认为与宿主早期防御反应有关，它可以间接地释放真菌诱导因子从而激发进一步的防卫反应[5]。在本研究鉴定出的第Ⅱ类几丁质酶中，有7个为跨膜蛋白，可能与宿主早期防御反应有关。

正常情况下，植物中的几丁质酶活性很低，但在受到病原物及其激发子、乙烯、水杨酸、紫外线及重金属等的诱导下，其活性迅速提高[21]。许多植物在感染病毒后几丁质酶活性急剧升高，而且会同时产生多种几丁质酶[22]。TMV病毒不仅能诱导黄瓜几丁质酶局部活性达600倍，而且还能诱导整个系统获得此酶活性[23]。真菌及其激发子可诱导植物中几丁质酶的活性急剧增加，在番茄、豌豆、油菜、菜豆等受到病原真菌侵染时均可产生较高的几丁质酶活性，且多种类型的几丁质酶共存；当用真菌细胞壁或激发子处理胡萝卜和马铃薯时也发现，几丁质酶活性增加[20]。植物几丁质酶还可受一些物理及化学因素诱导，在盐溶液喷洒、受伤、紫外辐射、升汞处理时，几丁质酶活性也会被诱导[24，25]。