马铃薯疮痂病病原菌的分离鉴定及其生长特性分析

宋素琴，高海峰，吕 卓，3，唐琦勇，顾美英，张志东，楚 敏，朱 静，王 玮

（1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；3.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052）

0 引言

【研究意义】新疆喀什地区泽普县属大陆性暖温带干旱气候，年平均气温11.7 ℃，年均降雨量50 mm，日照充足，土壤肥沃，无霜期长适合种植马铃薯。马铃薯疮痂病（potato common scab，简称PCS）是由放线菌目链霉菌属的疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）引起的土传细菌性病害[1]，当前马铃薯土传病害马铃薯疮痂病影响马铃薯的产量及品质。【前人研究进展】已报道疮痂病病原菌有S.cesscabies、S.acidiscabies、S.aureofaciens等50 多种[2]。杜鹃[2]研究报道了新疆伊犁地区马铃薯疮痂病，发现病原菌为S.acidiscabies和S.scabies，且S.acidiscabies的致病力明显强于S.scabies。2002年华北地区微型薯的疮痂病发病率达30%～60%；2010年浙江省义乌市马铃薯商品薯田疮痂病发病率超过50%；2013年内蒙古自治区11个县（旗、市）的商品薯生产中均有马铃薯疮痂病发生，病薯率达38%，18个种薯生产单位中15个有疮痂病发生，最严重病薯率达100%；2012年新疆阿勒泰市区马铃薯疮痂病发病率超过30%，而栽培脱毒微型薯的地区疮痂病发病较为严重，发病率可达30% ～50%，严重达到80%以上[3-4]。【本研究切入点】马铃薯疮痂病严重影响新疆马铃薯的产量和品质，对马铃薯产业尤其是脱毒种薯生产造成巨大损失。近年来，新疆泽普县疮痂病发病较严重但未见相关报道。需分离鉴定马铃薯疮痂病病原菌，并分析共生长特性。【拟解决的关键问题】采集新疆喀什泽普县阿依库勒乡4村的感病马铃薯，分离鉴定确定病原菌的种类并研究病原菌的形态及生长特性，为该病害的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病薯

病薯于2019年6月从新疆喀什地区泽普县阿依库勒乡4村采集，品种为荷兰十五，重茬连续4年种植。致病力测定所用材料均采购于乌鲁木齐某超市，马铃薯所用品种为费乌瑞它。

1.1.2 土壤样品

土壤样品采集于新疆喀什地区泽普县阿依库勒乡4 村马铃薯疮痂病薯薯田，采集时除去发病地块表层5 cm土壤，取5 ～15 cm耕作层土壤。

1.1.3 试剂与仪器

培养基：PDA，YME（麦芽浸粉10 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖4 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.2），胰胨酵母浸出物培养基（胰蛋白胨1.0 g/L、酵母浸粉1.0 g/L、NaCl8.5 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.2）

仪器：培养皿（90 mm）、试管（15 mm×150 mm）、小刀、酒精灯、灭菌竹签、涂布器等，均购自新疆鼎国昌盛有限公司。

设备：HVE-50 自动高压灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250BF 生化培养箱，上海福玛实验设备有限公司；SC-316 4℃立式保藏柜，海尔HAIER 公司；NEP025-1 回收试剂盒，鼎国昌盛有限公司；DL9700 PCR 仪，东林昌盛有限公司；CH20BIMF200 光学显微镜，日本Olympus有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与纯化

参考方中达[5]组织分离法。

1.2.2 致病力测定

1.2.2.1 薯肉

根据柯赫氏法则采用伤口接种测定致病性，包括针刺接种法[2]和打孔接种法[6]，接种后的马铃薯置于室温，30 d后观察发病情况。

1.2.2.2 薯皮

薯块表面用75%酒精消毒后，涂抹菌悬液，设置3个重复，30 d后观察对马铃薯薯皮的影响。

1.2.2.3 离体叶片

取健康马铃薯叶片，经75%酒精消毒后，置于放有无菌滤纸的无菌培养皿中，再在叶片表面滴加200µL菌株菌悬液并涂抹均匀，无菌滤纸保湿，设置3个重复，置于室温下15 d后观察。

1.2.2.4 盆栽实验

采用灌根的方式，选取健康的马铃薯块茎催芽，用无菌水冲洗干净，在灭菌的花盆土壤中植入有芽马铃薯2 块，芽尖向上，后将5 mL 菌液加入到芽尖土壤处，以等量无菌水做对照，播种前浇水1 000 mL，每组6 次重复。马铃薯出苗后每盆定植1 株，植株在室内光照室12 h 时日光灯下生长，每周浇1 次水并观察，生长120 d 后采收马铃薯块茎。

1.2.3 生物学特性测定

参考杜鹃等[2]方法，采用结晶紫染色法，显微镜下观察菌株孢子链和孢子的形态特征。生理生化测定指标[6]：菌株的碳源利用、氮源利用、敏感性和对淀粉的利用等，以及温度、pH 等对菌株生长特性的影响。

1.2.4 分子鉴定

16SrDNA 序 列 引 物 为PA（TTTGATCCTGGCTCAG）和 PH（AAGGAGGTGATCCAGCCGCA），按常规设置PCR 反应体系，PCR 产物经纯化、回收后，送鼎国昌盛有限公司测序。将获得的序列在NCBI 上进行Blast 比对，选取同源性较高和形态相近菌株序列进行发育树构建。表1

表1 常规PCR反应体系的扩增Table 1 16s rDNA sequence Amplification of conventional PCR reaction system

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

研究表明，在病薯上分离出编号为ZPCJ-1的菌株，为放线菌，在PDA 培养基表面凸起，产白色孢子，菌体丝状分枝极细，尖端常呈螺旋状并凸起，孢子圆筒形连接成链或附着在菌丝周围。图1

图1 菌株ZPCJ-1的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of ZPCJ-1

2.2 菌株ZPCJ-1的致病力

研究表明，接菌处理与对照基本一致，30 d后在薯皮涂抹菌液处网纹状病斑加深，严重时有内凹的疮口，去皮后发现薯肉并无变化。

15 d后菌株在离体叶片表面滋生大量白色孢子，但叶片未出现腐烂。

接菌的盆栽相比于对照，收获马铃薯块茎表皮出现许多网纹状病斑。图2

图2 菌株ZPCJ-1的致病性Fig.2 Determination of pathogenicity of pathogenic bacteria ZPCJ-1

2.3 菌株ZPCJ-1的生物学特性

研究表明，菌株ZPCJ-1 孢子光滑呈白色、自由弯曲状，在胰胨酵母浸出物培养基能够产生黑色素，在PDA培养基产生可溶性色素，可利用8种单一碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇，可以利用甲硫氨酸和组氨酸为单一氮源，对链霉素、青霉素、苯酚、结晶紫敏感，可利用淀粉，能在pH4.0 的培养基中生长。表2

表2 菌株ZPCJ-1的生物学特性Table 2 Biological characteristics of ZPCJ-1

2.3.1 温度对菌株ZPCJ-1菌落生长影响

研究表明，温度对菌株ZPCJ-1菌落生长影响显著（P＜0.05）。在25 ～30℃，菌落直径呈上升趋势，30 ～40℃菌落直径呈下降趋势，其中最适生长温度为30℃，12 d 菌落直径达到16.17 mm。菌株ZPCJ-1在25 ～40℃均可以生长，最适生长温度为30℃。图3

图3 不同温度下菌株ZPCJ-1生长变化Fig.3 Effect of temperature on ZPCJ-1 growth of strain

2.3.2 光照对菌株ZPCJ-1菌落生长的影响

研究表明，黑暗有利于菌株ZPCJ-1 的生长，12 d 菌落直径达到14.00 mm。全光照不利于菌株ZPCJ-1 的生长，12 d 菌株的菌落直径为6.00 mm。黑暗适宜该菌株生长。图4

图4 不同光照下菌株ZPCJ-1生长变化Fig.4 Effect of light condition on ZPCJ-1growth of strain

2.3.3 pH对菌株ZPCJ-1菌落生长影响

研究表明，菌株ZPCJ-1在YME、pH为4 ～10的范围内均能生长。pH 为3 时菌落未生长；但pH 为4 时病菌生长；较佳pH 值为7，菌落直径达16.17 mm；pH为11以及12时，菌株不生长。图5

图5 不同pH下菌株ZPCJ-1生长变化Fig.5 Effect of pH on ZPCJ-1 growth of strain

2.3.4 不同碳源与氮源对菌株ZPCJ-1 菌落生长的影响

研究表明，在YME 培养基上，以葡萄糖作为碳源，有利于菌株的生长，12 d 其菌落直径达到15.50 mm，其依次为蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、CK、鼠李糖、肌醇，其菌落直径依次为12.17、10.50、7.70、6.50、5.33、5.17、3.83 和3.50 mm。

以甲硫氨酸为氮源适宜菌株生长，菌落直径达到11.33 mm。图6

图6 不同碳氮源下菌株ZPCJ-1生长变化Fig.6 Effect of carbon and nitrogen sources on ZPCJ-1 growth of strain

2.4 菌株ZPCJ-1的分子鉴定

研究表明，扩增出约1 500 bp的16S rDNA片段。菌株ZPCJ-1与Streptomyces acidiscabiesATCC 49003（D63865）的同源性为100%，结合致病性测定结果与生物学特性确定菌株ZPCJ-1 为疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）。图7

图7 用于ZPCJ-1鉴定的PCR扩增电泳图谱及系统发育树构建Fig.7 PCR amplification electrophoresis map and construction of phylogenetic tree for identification of ZPCJ-1

3 讨论

疮痂链霉菌（S.acidiscabies），田间症状为块茎表面出现近圆形至不定形木栓化疮痂状淡褐色病斑或斑块，手摸质感粗糙，呈凸起裂口状病斑[8，9]。这类病原菌在中国、日本、韩国均有报道[10]，我国山东[11]、黑龙江[12]、山西[13]、甘肃[14]等地均发现该病菌。已报道的疮痂病病原菌还有S.scabies、S.acidiscabies、S.aureof aciens、S.europaeiscabiei等50种[2，24，25]，我国主要有S.scabies、S.turgidiscabies和S.acidiscabies3种[15]；杜鹃在我国新疆伊犁地区分离到S.acidiscabies和S.scabies，其中优势种为S.acidiscabies[2]。我国马铃薯种植区的疮痂病病原菌同样具有遗传多样性，不同产区病原菌种类、数量及致病程度存在明显差异[5，16,17]。马铃薯疮痂病菌还可以侵染萝卜、甜菜等其它作物，菌株对青霉素、苯酚、链霉素等均敏感，与已报道的S.acidiscabies菌株的特性一致[12]。

研究结果表明，适合菌株ZPCJ-1的适宜温度为25 ～34℃，最适生长温度为30℃；黑暗更有利于菌株生长；当pH 为4 时，菌株可以生长，最适pH为7；适宜生长的碳源和氮源分别是葡萄糖和甲硫氨酸。不同于崔凌霄[22]、李驰[3]、陈志垚[18]等的研究结果，与菌株的种类、生长环境、地理区域等有关

我国疮痂病病原菌种类及其组成有明显的多样性特征。明确特定地区病原菌的构成对了解及防治疮痂病十分重要[23]。

土传病害防治难度大，培育抗性品种是病害防治最经济有效的方法[24]。轮作倒茬、合理施肥，尤其降低磷肥用量，可改善土壤微生物群落结构，减少疮痂等土传病害发生，利于马铃薯产业可持续发展[25，26]。

4 结论

在新疆泽普县的感病马铃薯中分离鉴定马铃薯疮痂病的病原菌为疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies），产白色光滑呈自由弯曲状的孢子，能产生黑色素和可溶性色素，可利用葡萄糖等8种碳源和甲硫氨酸（Met）和组氨酸（His）2种氮源，接种健康马铃薯块茎上能产生网纹状甚至凹陷裂口状病斑。最适生长温度为30℃，pH 为7，最适碳氮源为葡萄糖和甲硫氨酸，全黑暗利于菌株的生长。