地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的静置处理工艺优化

崔联明，王 琳，高丽敏，郭东森，周 影，魏启舜

（1.江苏丘陵地区南京农业科学研究所，江苏 南京 210046；2.江苏开放大学 乡村振兴学院，江苏 南京 210000）

随着畜禽业的发展，全球每年产生羽毛废弃物超过1000万t[1]，我国每年羽毛废弃物产生量也在百万t以上。羽毛中角蛋白含量超过85%，是一种潜在的氨基酸和蛋白来源。角蛋白是一类难溶于水且富含多种氨基酸的纤维状结构蛋白，分子链内和分子链之间存在二硫键、氢键、盐键等结构，使其化学性质稳定，难以被降解利用，因此大量羽毛被填埋及焚烧，造成了严重的资源浪费、环境污染，甚至引起疾病[2]。因此，充分利用羽毛废弃物不仅可以减轻环境污染，还能促进资源的循环利用。

羽毛经降解可产生氨基酸，氨基酸是参与合成蛋白质的基本分子，是保障动植物进行正常生理活动的重要组分。在农业生产中，氨基酸作为植物必须的营养元素，具有分子量小、容易被动植物吸收利用的特点，能够有效促进作物生长、提高作物产量并改善品质[3-4]。袁祖华等[5]通过在辣椒叶面喷施氨基酸肥，辣椒的产量和品质均得到了提高。人类需要从外界获取8种必需氨基酸，分别是：亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸。谷氨酸钠是最早被人类应用的氨基酸，作为味精的主要成分被广泛应用于调味剂中。在医药行业中，氨基酸对许多消化道疾病、心血管病、呼吸道病等有良好的疗效，且许多药物已投入生产。徐莉英等[6]合成出了β-榄香烯氨基酸的衍生物，其被证明具有抗肿瘤活性。此外，氨基酸在水产、畜牧业中也常常作为添加剂，在保健品中也有广泛的应用。

目前，羽毛的降解主要依靠物理法（高温蒸煮法和膨化法）和化学法（酸碱水解法）[7]，但存在着能耗高、工艺复杂、污染环境、破坏氨基酸结构、造成产品营养损失等问题[8]。微生物法和酶解法作为2种新兴的羽毛降解技术，具有过程温和、对氨基酸破坏较小，降解效果显著等优点。但酶解法存在成本高、单一酶降解效果不好等问题，而利用微生物直接降解羽毛步骤简单，成本低廉，但需要对样品的前处理和发酵工艺进行进一步优化以提高氨基酸转化率。

先前研究筛选到一株高效羽毛降解菌地衣芽孢杆菌ZSZ6[9]，其在好氧发酵条件下，氨基酸转化率约为19%。本研究通过优化地衣芽孢杆菌ZSZ6的发酵工艺，研究了静置处理前的好氧培养时间、静置温度、还原剂预处理、添加金属离子等对羽毛降解产氨基酸效果的影响，综合比较了各种处理对羽毛降解氨基酸产量的影响，以期寻求最佳的静置处理工艺。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 地衣芽孢杆菌ZSZ6由江苏丘陵地区南京农业科学研究所微生物实验室筛选、保存。

1.1.2 羽毛粉 羽毛粉购自安徽文翔羽绒制品有限公司。

1.1.3 培养基 种子培养基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化钠10 g·L-1，pH值7.2～7.4；121℃下高压灭菌20 min。羽毛粉培养基：磷酸二氢钾1 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1、氯化钠1 g·L-1、羽毛粉10%，pH值7.2～7.4；在121℃下高压灭菌20 min。所有试剂均选用商业分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 游离氨基酸含量的测定 采用茚三酮法GB/TB 314—2013。

1.2.2 好氧发酵后静置对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响 向装液量为100 mL的羽毛粉培养基中加入5%（v/v）地衣芽孢杆菌ZSZ6，对照组CK发酵条件为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养；试验处理组为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养2 d后于37℃静置反应。测定2种处理组2～7 d的氨基酸含量。

1.2.3 好氧发酵时间对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响 向装液量为100 mL的羽毛粉培养基中加入5%（v/v）地衣芽孢杆菌ZSZ6，对照组CK发酵条件为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养；试验处理组为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养0.5、1、2 d后，于37℃静置反应。测定几种处理组2～7 d的氨基酸含量。

1.2.4 静置温度对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响 向装液量为100 mL的羽毛粉培养基中加入5%（v/v）地衣芽孢杆菌ZSZ6，对照组CK发酵条件为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养；试验处理组为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养2 d后，分别于37、45、55℃条件下静置反应。于第6天测定几种处理组氨基酸含量。

1.2.5 还原剂预处理羽毛粉对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响 向装液量为100 mL的羽毛粉培养基中加入5%（v/v）地衣芽孢杆菌ZSZ6，并分别添加1%（w/v）的二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、Na2SO3，并将地衣芽孢杆菌ZSZ6按照5%（v/v）的接种量接种到羽毛粉培养基中，对照组CK发酵条件为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养；试验处理组为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养2 d后，于55℃条件下静置反应。第6天测定几种处理组氨基酸含量。

1.2.6 添加金属离子对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响 向装液量为100 mL的羽毛粉培养基中加入5%（v/v）地衣芽孢杆菌ZSZ6，对照组CK发酵条件为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养；试验处理组为37℃、180 r·min-1条件下摇床培养2 d后，分别添加0.1%（w/v）的FeSO4、FeCl3、CuSO4、MnSO4、MgSO4后静置反应，并检验添加最优金属离子的其他盐类后菌株降解羽毛粉的氨基酸产量。第6天测定几种处理组氨基酸含量。

1.2.7 50 L发酵罐条件下静置处理对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响 （1）提前泡发2组3 kg的羽毛粉，第1组不添加Na2SO3，第2组添加1%的Na2SO3，静置过夜。

（2）将地衣芽孢杆菌ZSZ6一级种子液按照2%的比例接种到LB液体培养基中，37℃、180 r·min-1培养16 h得到二级种子液。

（3）发酵罐进行过滤器灭菌和空消后，将含有羽毛粉的羽毛培养基加入发酵罐内并加水至22 L进行实消。待冷却至室温后，按照5%的比例加入二级种子液进行发酵。

第1组发酵条件：控制pH值为7，搅拌转速180 r·min-1，发酵温度37℃，溶氧DO在20%～40%，共6 d。

第2组调整发酵条件：第一阶段为菌体生长阶段（48 h内），初始pH值为7，搅拌转速180 r·min-1，发酵温度37℃，溶氧DO控制在20%～50%；第二阶段为羽毛粉降解产氨基酸阶段（48 h后），调整pH值至8，温度至55℃，加入0.1%MnSO4，并停止搅拌和通气，每隔12 h进行1次持续15 min的搅拌，继续发酵4 d。

1.3 数据分析

每个处理组重复3次，结果以平均值±标准差（SD）表示。采用SPSS 19和GraphPad Prism 8软件进行数据处理、统计分析和绘图，所有数据采用LSD方法进行多重比较，不同字母表示LSD检验5%水平差异显著。

2 结果与分析

2.1 好氧发酵后静置对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响

先前研究探究了地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛产游离氨基酸的最适发酵条件，本试验在其基础上探究了静置处理对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产游离氨基酸的影响。结果显示（图1），在整个发酵过程中，传统的好氧发酵和好氧发酵2 d后进行静置处理的2种发酵过程中游离氨基酸的含量均持续上升，但是静置处理条件下氨基酸浓度上升速度明显高于传统好氧发酵。发酵第7天，持续好氧发酵游离氨基酸产量约为19.25 g·L-1，好氧发酵2 d后静置处理游离氨基酸产量约为28.85 g·L-1。

图1 传统好氧发酵(CK)和静置处理对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

2.2 好氧发酵时间对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响

为探究地衣芽孢杆菌ZSZ6最佳生长、产酶时间，分别将细菌培养0.5、1、2 d后进行静置，以确定最适好氧培养时间。结果显示（图2），在发酵第2天，好氧发酵2 d的氨基酸浓度高于好氧发酵0.5、1 d，且在整个发酵过程中好氧发酵2 d的氨基酸浓度均高于好氧培养0.5、1 d。发酵第7天，好氧发酵0.5、1、2 d的最终氨基酸浓度分别为14.39、20.35、22.10 g·L-1。

图2 好氧发酵时间对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

2.3 静置温度对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响

不同酶类的最适温度不同，为进一步探究地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉的最佳静置温度，笔者研究了3种不同静置温度对发酵液中氨基酸含量的影响。结果显示（图3），在发酵第6天，于55℃静置条件下氨基酸浓度明显高于37℃和45℃静置。这表明在好氧发酵2 d的条件下，55℃是最适降解温度，推测原因可能是地衣芽孢杆菌ZSZ6所产的角蛋白酶在该条件下能保持较高的酶活。

图3 静置温度对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

2.4 还原剂预处理羽毛粉对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响

适当的预处理能够使角蛋白更易降解，因此，笔者研究了3种还原剂1%（w/v）的DTT、巯基乙醇、Na2SO3对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响。结果显示（图4），使用1%的Na2SO3预处理羽毛粉够明显提升氨基酸的浓度，达到29.22 g·L-1，比对照提高约11%。使用1%DTT和巯基乙醇进行预处理则会降低氨基酸浓度。

图4 还原剂预处理对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

2.5 添加金属离子对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响

金属离子可能对酶活性存在一定影响，不同的金属离子会对酶产生促进或者抑制作用。本试验研究了在好氧培养阶段后、在静置之前，添加不同金属离子对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响。结果显示（图5），FeSO4、FeCl3、CuSO4、MnSO4、MgSO4对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸均有一定提高，其中MnSO4提升量最大，在第6天达到约35.41 g·L-1，比对照（26.23 g·L-1）提高了约35%。此外，本研究验证了MnSO4、MnCl2、Mn(NO3)2对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响（图6）。结果显示，不同锰盐之间并没有表现出差异。这表明锰盐对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸产生的影响主要是依赖于锰离子。

图5 金属离子对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

图6 不同锰盐对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

2.6 50 L发酵罐条件下静置处理对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的影响

为进一步检验静置处理在扩大化处理的情况下是否能提高氨基酸的产量，笔者研究了在50 L发酵罐水平下静置处理对羽毛粉降解产氨基酸的影响。结果如图7所示，2个处理组在2～5 d的时间内氨基酸浓度均有所提高，但静置处理组的提高速度远大于对照组。在测量的6 d内，CK组生产氨基酸在第6天达到峰值，约为17.51 g·L-1；静置组在第5天可以达到峰值，约为39.50 g·L-1。由此可见，即使在扩大化处理的复杂情况下，静置处理仍然能够大幅提高氨基酸产量。

图7 50 L发酵罐水平下静置处理对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸效果的影响

3 结论与讨论

角蛋白的空间结构存在着很多的氢键、二硫键、疏水键等强相互作用，形成了复杂的三维超螺旋结构，使角蛋白的结构复杂而紧密，难以被降解，部分还原剂有助于促使角蛋白中二硫键的断裂，加速角蛋白的降解[10]。角蛋白酶是一种可降解水不溶性角蛋白的酶，其来源于一些具有角蛋白降解活性的细菌、真菌、放线菌。目前已报道的可以降解羽毛角蛋白的微生物种类繁多，研究表明地衣芽孢杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌、梭状芽孢杆菌[11]、枯草芽孢杆菌[12]等降解羽毛的效果显著，且与角蛋白酶的活性密切相关。张昕[13]通过对枯草芽孢杆菌的发酵培养基及发酵条件的优化，在72 h羽毛降解率为69.61%；发酵液的氨基酸含量达22.66 mg·mL-1；周莲等[14]通过对解淀粉芽孢杆菌3-2发酵羽毛的发酵工艺优化，在108 h氨基酸总含量达到20.861 g·kg-1。本研究对地衣芽孢杆菌ZSZ6进行发酵工艺优化，摇瓶条件下在第6天氨基酸含量可达35.41 g·L-1，高于其他菌株发酵效果，实现了氨基酸产量的大幅提升。

羽毛降解产氨基酸主要依赖于角蛋白酶，而角蛋白酶的活性受到多种因素影响。一般认为，微生物在降解羽毛时会产生多种酶类联合降解角蛋白。Williams[15]研究了一株从厌氧条件下分理处的地衣芽孢杆菌，发现其好氧生长快于厌氧生长，而在厌氧条件下降解角蛋白积累氨基酸的能力优于好氧条件。这一结果和笔者得到的结果相一致（图1），推测原因可能是在好氧发酵过程中，地衣芽孢杆菌ZSZ6可能会利用部分氨基酸替代羽毛粉进行生理活动，导致体系中氨基酸含量的减少；而静置处理造成了厌氧的环境条件，使好氧菌正常生长代谢降低，减少了对氨基酸的消耗。因此，在细菌生长繁殖、产酶达到一定程度后，进行静置处理能够有效提高体系中氨基酸的含量。不同微生物分泌的角蛋白酶的最适温度存在一定差异，常见的角蛋白酶最适温度在35～60℃之间。地衣芽孢杆菌ZSZ6在37℃，180 r·min-1培养2 d时，体系中细菌数量和酶活均达到了最适宜降解羽毛粉的条件（图1、图2），并在55℃静置时氨基酸产量最高（图3）。大部分金属离子都会对角蛋白酶活存在一定影响，如Mg2+、Ca2+、Mn2+对很多角蛋白酶有促进作用，而Zn2+、Cu2+、Hg2+等对部分角蛋白酶表现出较强的抑制作用[16-17]。本研究中Mn2+极大的提高了氨基酸的产量，且Cu2+和Fe3+也有一定的提升作用（图5、图6）。还有研究表明，一些还原剂如DTT、巯基乙醇、亚硫酸钠等可以提高角蛋白酶的活性[18]，而本研究中DTT、巯基乙醇对氨基酸的产量有明显的抑制作用（图4），推测原因可能是3种还原剂可以加速羽毛中二硫键断裂，但是DTT和巯基乙醇会对地衣芽孢杆菌ZSZ6生长产生抑制作用，而Na2SO3则不会影响对细菌产生负面影响。

本研究初步探究了静置处理下地衣芽孢杆菌ZSZ6对降解羽毛粉产氨基酸的影响，并进一步优化了降解条件，提高了游离氨基酸产量。通过单因素试验考察外加静置处理前的好氧培养时间、静置温度、还原剂预处理、添加金属离子等对羽毛降解产氨基酸效果的影响。结果表明，经1%Na2SO3预处理的羽毛粉，在37℃、180 r·min-1好氧发酵2 d后，添加0.1%MnSO4并置于55℃条件下静置处理，在优化条件下发酵6 d，产物中的游离氨基酸含量可达35.41 g·L-1（比对照组提高约84%），转化率约35%（比对照组提高约16%），极大地提高了氨基酸产量，这表明静置处理是一种能够有效提高地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛粉产氨基酸的方法，后续研究需要进一步优化其在羽毛降解上的应用。