2种彩叶植物穿孔病病原菌的形态学鉴定及室内药剂筛选

肖宇

（唐山园林科学研究所，河北 唐山，063000）

紫叶李和红叶碧桃作为重要的彩叶树种，是观花、观果和观叶集一起的优良观赏树种，既可以提供良好生态效益，又可以产生较高的经济效益。这2种植物在唐山地区园林绿化工程中得到了大量的应用。其树叶色彩艳丽，树形多样，观景时间长，容易形成大面积观赏群。但是随着紫叶李和红叶碧桃栽培应用的逐渐增加，其病虫害的发生也随之增加，其中以褐斑穿孔病较为严重。褐斑穿孔病发生初期，叶片上出现紫褐色小点，后期逐渐扩展为圆形或近圆形，略带轮纹，直至病斑脱落形成穿孔。湿度大时，病斑处出现灰色霉状物，同时也危害枝稍。发生严重时引起落叶，甚至植株死亡，造成经济损失。此病侵染的植物种类繁多，如桃树、樱桃树、李树等[1-4]。

目前对紫叶李和红叶碧桃的研究大多数都聚焦在环境因子以及栽培管理方面[5-13]，如盐胁迫、光照、温湿度、施肥等因素。紫叶李和红叶碧桃上发生病虫害及其防治的研究也多有报道[14-24]，但针对褐斑穿孔病的相关研究比较少，仅李莉[16]和霍学红[17]对紫叶李褐斑穿孔病进行过报道，在红叶碧桃上的研究鲜有报道。不同农药对这2种植物上褐斑穿孔病菌的抑制效果没有系统的比较分析。

褐斑穿孔病是真菌引起的病害，真菌的鉴定可以从形态学和分子生物学2方面进行。目前在园林绿化养护过程中，对植物病害的防治仅是根据病害症状进行防治，具有盲目性，为病害的根本防治带来困难。对病害病原菌进行形态学鉴定，明确引起植物病害的病原菌具体的分类地位，进而为病害的根本防治提供依据。当前对紫叶李和红叶碧桃上褐斑穿孔病及其病原菌的防治药剂及防治效果还缺乏针对性研究。因此本研究对这2种彩叶植物褐斑穿孔病病原菌进行分离、纯化和形态学鉴定，初步确定其在真菌中的分类地位，选取6种药剂，测定了对褐斑穿孔病菌的抑制作用，旨在为该病在田间有效防治提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株材料 紫叶李穿孔病菌株Z1、Z2，分离自唐山市大钊公园内发病的紫叶李植株上；红叶碧桃穿孔病菌株B1、B2，分离自唐山市西外环绿化带内发病的碧桃植株上。以上菌株均经过分离纯化并由本实验室保存。

1.1.2 试验药剂A：20%二氯异氰尿酸钠SP（威海韩孚生化药业有限公司），B：80%代森锰锌WP（河南省莱恩坪安园林植保有限公司），C：80%多菌灵WP（北京为民生物科技有限公司），D：20%二氯异氰尿酸钠SP（河南省莱恩坪安园林植保有限公司），E：16%苯甲·中生WP（深圳诺普信农化股份有限公司），F：1.2%辛菌胺醋酸盐AS（山东胜邦绿野化学有限公司）。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖培养基（PDA），按方中达[25]方法配置。

1.2 试验处理

18个处理：A稀释300、500倍；B稀释1500、2000倍；C稀释500、1000倍；D稀释500、800倍；E稀释500、600、750、800、1000倍；F稀释50、100、150、200、300倍。均用无菌水稀释。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离 根据方中达[25]方法，进行真菌的常规分离纯化，并保存于PDA斜面试管中。

1.3.2 病原菌致病性测定 采集紫叶李和红叶碧桃新长成的健康嫩叶，用清水冲洗干净，用70%的酒精进行表面消毒，用灭菌后的蒸馏水冲洗3次，叶柄部用湿棉球包裹住保湿，平铺在有3层滤纸的培养皿中备用；用接种针挑取平板上孢子，接种于带有人工处理伤口（用砂纸轻轻擦伤）的叶片上，培养皿内保持一定的湿度，放置在26℃的恒温培养箱内培养，每个处理设置3个重复，对照为无菌水处理的叶片，逐日观察，记录接种结果。

1.3.3 菌株形态学特征的观察 将分离纯化得到的菌株接种在PDA培养基上培养，期间观察并记录下菌株在培养基上的生长状况，并用插片法[26]检查菌株的形态特征，根据记录的菌株生长状况、菌落特征和菌丝、分生孢子梗、分生孢子的形态特征，按照真菌鉴定手册、中国真菌志[27-29]进行分类检索，确定各个菌株在分类学中的分属。

1.3.4 药剂抑制作用 在无菌的条件下，将配置好的PDA培养基冷却至50℃左右，加入配置好的母液，混合均匀后倒入培养皿中待用。取1 mm×1 mm大小的生长菌丝块接到含有药剂的PDA培养基中央，于26℃恒温培养箱中培养，设置3次重复，不含药培养基作为对照。每24 h观察记录菌落的直径，4 d后计算各农药制剂的抑菌率。

抑菌率=（对照培养基菌落直径-加药培养基菌落直径）/对照培养基菌落直径×100%

菌斑相对直径=加药培养基菌落直径/对照培养基菌落直径×100%

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态学特征

菌株Z1：菌落不透明，圆形，菌丝绒毛状、丰富，初期白色或青色，后期灰褐色或灰黑色，菌落背面绿色至青褐色。菌丝有隔膜；分生孢子梗浅褐色，有分隔，直立或屈膝状弯曲。分生孢子单生，或成短链生，卵形或椭圆形，中褐色至深褐色，具横纵隔膜。根据其形态学的鉴定，初步确定菌株Z1为链格孢属真菌（图1）。

图1 菌株Z1的形态特征

菌株Z2：菌落圆形，表面平展，呈密实的绒状，灰白色至青绿色，背面淡褐色至黑色，有同心轮纹。菌丝有隔膜；分生孢子梗直或弯曲，淡褐色，有分隔。分生孢子倒棍棒状、卵形或椭圆形，黄褐色，有横纵隔膜。根据其形态学的鉴定，初步确定菌株Z2为链格孢属真菌（图2）。

图2 菌株Z2的形态特征

菌株B1：菌落圆形，表面附有密实的绒毛状菌丝，灰白色至灰褐色，边缘整齐；背面淡褐色至黑色。菌丝有隔膜，分生孢子梗淡褐色至褐色，有分隔，有分支，直或者弯曲。分生孢子倒棍棒状，卵形、倒梨形或近椭圆形，淡褐色至褐色，有横纵隔膜，分隔处不缢缩或略缢缩。短喙柱状或锥状，部分转变为产孢细胞（假喙）。根据其形态学的鉴定，初步确定菌株B1为链格孢属真菌（图3）。

图3 菌株B1的形态特征

菌株B2：菌落圆形，表面呈密实的绒状，边缘整齐，灰白色至青绿色，背面淡褐色至黑色。菌丝有隔膜；分生孢子梗直或弯曲，淡褐色，有分隔，偶有分枝。分生孢子倒棍棒状，卵形或长椭圆形，黄褐色，有横纵隔膜。根据其形态学的鉴定，初步确定菌株B2为链格孢属真菌（图4）。

4株菌株在菌落表面均呈绒毛状，但颜色存在差异；分生孢子梗均有分隔；分生孢子的颜色为淡褐色至深褐色之间，均有隔膜，差异在于分生孢子形状以及大小、有无缢缩、有无假喙。

2.2 病原菌的致病性测定结果

接种试验结果显示，26℃恒温培养2 d后，4株菌株均能在接种点处出现菌丝（图5），4 d开始形成病斑，与自然发病的叶片叶斑一致。后期病斑扩大至整个叶片，有的叶片出现穿孔。结果符合柯赫氏法则，表明4株菌株为褐斑穿孔病的病原菌。

图5 紫叶李叶片离体接种试验

2.3 不同农药及倍数对褐斑穿孔病菌的抑制效果

由表1可以看出，只有50倍1.2%辛菌胺醋酸盐AS对菌株Z1的抑菌率在90%以上，效果较好，其他抑菌效果次之；600、750倍16%苯甲·中生WP以及50、100、200倍1.2%辛菌胺醋酸盐AS对菌株Z2的抑菌率在90%以上，效果较好，其他的试验处理抑菌效果次之，20%二氯异氰尿酸钠SP（D）和80%代森锰锌WP抑菌效果最差；500倍多菌灵、500倍苯甲·中生和50倍辛菌胺醋酸盐对菌株B1的抑菌率达到90%以上，效果较好，其他的试验处理抑菌效果次之，800倍20%二氯异氰尿酸钠SP（D）和80%代森锰锌WP抑菌效果最差；500倍80%多菌灵WP，500、600、750、1000倍16%苯甲·中生WP，50倍1.2%辛菌胺醋酸盐AS对菌株B2的抑菌率在90%以上，其他的抑菌效果次之，500倍20%二氯异氰尿酸钠SP（A）、80%代森锰锌WP和800倍20%二氯异氰尿酸钠SP（D）抑菌效果最差。

表1 不同农药及浓度对褐斑穿孔病菌的抑制效果

3 结论与讨论

本研究从菌落颜色、分生孢子的形态特征和菌丝有无隔膜等方面，初步确定了分离纯化的菌株Z1、Z2、B1和B2为链格孢属真菌。园林植物上常用的杀菌剂有多菌灵、甲基硫菌灵、三唑酮、百菌清和代森锰锌等。本试验选取了市场上出现比较频繁的6种农药制剂，测定其对褐斑穿孔病菌的抑制作用。结果发现，1.2%辛菌胺醋酸盐AS、80%多菌灵WP和16%苯甲·中生WP对菌株的抑制效果较佳，该结果对田间防治褐斑穿孔病具有一定指导作用。

本试验只是在形态学方面对褐斑穿孔病病原菌进行了鉴定，虽然4株病原菌的分生孢子存在差异，但是形态学鉴定不能鉴别病原菌的种或者专化型。试验中还发现同一农药的同等浓度对不同的褐斑穿孔病菌菌株表现出的抑制作用存在较大差异，这与链格孢属真菌的小种或专化型之间对农药的敏感度存在差异[30]。总有效成分含量相同的药剂，由于不同的生产厂家，对相同菌株的以及作用也存在差异。长时间使用同一药剂防治褐斑穿孔病，有可能使病原菌产生抗药性，为防止病原菌抗药性产生，可交替使用其他作用机制的药剂。综合本试验结果，对田间褐斑穿孔病防治提供了一些基础。