芦笋茎皮喷雾干燥工艺优化及化学成分的超高效液相色谱-串联质谱分析

李紫珊，卫 瑞，李震宇

(山西大学中医药现代研究中心，山西 太原 030000)

芦笋(Asparagus officinalisL.)，又名石刁柏、龙须菜，为百合科天门冬属宿根性多年生草本植物。芦笋鲜嫩可口，富含多种营养成分，如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、硒、锌、铁以及矿物质等。芦笋具有提高免疫力、燃烧脂肪、抗疲劳、保肝解毒、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抗肿瘤等作用[1]。芦笋在生产加工过程中会产生老茎、皮等大量的废弃物。研究表明，这些废弃物同样富含黄酮和皂苷类成分，具有资源利用价值[2-3]。

喷雾干燥是近年发展起来的一种新型高效干燥工艺，可将溶液、乳液或悬浮液干燥为固体粉末或颗粒[4-5]。喷雾干燥具有制备工艺简单、营养成分保存好、溶解性好、快速、可重现、可连续、操作方便等诸多优势，在医药、食品、化工、等领域应用广泛，且所得产品易于贮藏和运输[6-8]。

本研究采用超高效液相-四级杆-飞行时间高分辨质谱联用（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技术快速分析鉴定芦笋茎皮喷雾粉中的化学成分，通过化合物的精确分子量、MS/MS裂解规律以及文献中报道的数据等信息对喷雾粉中的化学成分进行鉴定。UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合了UHPLC和QTOF-MS/MS的优点，具有分辨率高、重复性好、分析时间短、准确性高等优点，广泛应用于中药及其复方中化学成分的鉴定[9]。

本研究以绿芦笋生产加工过程中产生的下脚料芦笋茎皮为原料，采用喷雾干燥技术将其制备成喷雾干燥粉，利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术快速分析鉴定喷雾粉中的化学成分，并对其溶化性、润湿性、含水量、溶解度等理化指标进行测定，旨在将其开发成一种新型功能食品原料，提高芦笋废弃资源利用率，为芦笋产业的发展和创新提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

芦笋茎皮购买于山西省永济市耀辉绿色芦笋种植专业合作社；纯水、甲醇等其他试剂均为国产分析纯；乙腈（质谱级，美国Thermo公司），超纯水由中医药现代研究中心制备。Milli-Q纯净水系统（美国Millipore公司）；HH-S4恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；ZNHW电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；PX822ZH天平（奥豪司仪器有限公司）；LC-4012离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；RE5299旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SP-1500试验型喷雾干燥机（上海顺仪实验设备有限公司）；超声波清洗器KQ5200E（昆山市超声仪器有限公司）,ExionLCTMAD超高效液相色谱仪；QTOF 5600+四极杆飞行时间质谱仪（美国AB Sciex公司）

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程 芦笋茎皮→煎煮水提→真空减压浓缩→测定可溶性固形物含量→添加辅料→调整密度→喷雾干燥→理化指标测定、化学成分分析。

1.2.2 料液的提取 采用水煎煮的方法制备芦笋茎皮提取液。称取一定量的药材，第一次加入16倍量水，煎煮提取2h，过滤。在滤渣中加入10倍量水，煎煮提取2 h，过滤。将两次的滤液合并，浓缩，备用。

1.2.3 喷雾干燥单因素试验 对影响提取液喷雾干燥效果的主要因素，如进风温度、进样流量以及料液密度进行考察。

（1）进风温度。固定进样流量为450 mL·h-1、料液密度为1.07 g·cm-3，考察进风温度（100、130、160℃）对喷雾粉质量的影响。

（2）进样流量。固定进风温度为130℃、料液密度为1.07 g·cm-3，考察进样流量（350、450、550 mL·h-1）对喷雾粉质量的影响。

（3）料液密度。固定进风温度为130℃、进样流量为350 mL·h-1，通过添加麦芽糊精调节料液密度，并考察不同料液密度（1.05、1.07、1.09 g·cm-3）对喷雾粉质量的影响。

1.2.4 理化指标测定方法（1）得率。精密量取一定量提取液（mL），烘干至恒质量（g），计算提取液中固形物的含量[10]。得率计算公式如下：

产品得率=喷雾干燥出粉量（g）/（料液总固形物含量+麦芽糊精量）（g）×100%

（2）含水量。采用GB5009.3—2016中的第二法（减压干燥法）[11]，将供试品置于真空减压干燥箱内，设置压力40～53 kPa，温度（60±5）℃，烘干至前后2次质量差不超过2 mg，通过烘干前后的数值计算出含水量。

（3）溶化性。取供试品10 g，加入热水200 mL，搅拌5 min，立即观察，粉末应全部溶化或轻微浑浊[12-13]。

（4）溶解度。在干燥至恒质量的10 mL离心管（最小刻度0.1 mL）中加入精密称定的供试品0.5 g，加入沸水10 mL，搅拌振荡5 min。喷雾粉溶解后溶液微浊，3000 r·min-1离心15 min，弃去上清液，在80℃将残渣烘干至恒质量，精密称定，计算溶解度[14]。溶解度计算公式如下：

溶解度=溶化颗粒质量/总颗粒质量×100%

（5）润湿性。选取直径为95 mm的培养皿，加入50 mL蒸馏水，水温为25℃。在培养皿中加入2.5 g供试品，测定喷雾粉被水完全润湿的时间（不借助任何外力，不搅拌）[15-16]。

1.2.5 质谱分析方法（1）样品溶液的制备。取喷雾干燥粉5 g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶解，超声提取30～40 min，冷却至室温，滤液过0.22 μm微孔滤膜，4℃冰箱备用。

（2）色谱条件。色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；洗脱梯度：0～10 min（2%B），10～20 min（15% B），20～25 min（25% B），25～30 min（40% B），30～32 min（80% B），32～35 min（95% B），35～39 min（2%B）；柱温40℃；流速0.3 mL·min-1；进样体积2 μL。

（3）质谱条件。采用正负离子模式分别进行扫描，电喷雾离子源（ESI）。离子源参数如下：喷雾电压5500 V（正离子），-4500 V（负离子）；离子源温度450℃；加热气（Gas 2）55 psi、喷雾气（Gas 1）55 psi、气帘气（CUR）30 psi、去簇电压（DP）60 V，二级碰撞能量（CE）为（40±20）eV。TOF MS一级扫描范围为m/z 100～1500，Production scan二级扫描范围为m/z 50～1250。

（4）化合物鉴定。查阅芦笋相关成分研究文献，通过与文献中化合物的准分子离子峰、碎片裂解规律进行比对分析，在满足质量偏差≤5条件下，最终确定化合物的结构。

2 结果与分析

2.1 喷雾干燥单因素条件的确定

由表1可知，当温度过低时，喷雾粉水分含量大，易吸潮结块；过高时，喷雾粉粉质较粗。当进样流量较小时，粉质细腻、色泽呈乳白色或淡黄色、粘壁量少；过大时，喷雾粉水分含量大、粉质粗、粘壁量大、产率低。当料液密度较小时，喷雾粉水分含量高，易吸潮结块；较大时，料液太浓、固形物和辅料容易沉淀，将机器管道堵塞。综上所述，芦笋茎皮喷雾干燥最优试验条件为：流速350 mL·h-1、密度1.07 g·cm-3，温度130℃。

表1 喷雾干燥单因素试验结果

2.2 最优条件下制得的喷雾粉质量分析

按照上述最优条件，平行制备3批芦笋茎皮喷雾粉，并分别对其进行外观性状分析和理化指标测定，测定结果如表2所示。3批喷雾粉的得率均大于50%，得率较高；含水量低；完全润湿时间大于20 min，润湿性小，不易吸潮，可长期储存；溶解后无明显杂质或沉淀，溶化性和溶解度较好；粉质细腻、颜色鲜亮、滋味独特。

表2 喷雾粉理化指标和外观性状分析

2.3 基于质谱裂解途径的芦笋茎皮喷雾粉成分分析

目前，对于芦笋喷雾干燥粉的工艺研究较多，但是对喷雾粉的成分分析较少，本研究利用UHPLCQ-TOF-MS/MS技术在芦笋茎皮喷雾粉中共鉴定出38个活性成分，见表3。

表3 芦笋茎皮喷雾粉的化学成分鉴定

2.3.1 皂苷类 在喷雾粉中共鉴定出5个甾体皂苷类化合物，其结构见图1。其中以菝葜皂苷元为苷元的甾体皂苷，包括ShatavarinⅨ、Asparinin B、Asparagoside A和(25S)-5beta-spirostan-3beta-yl-O-[O-Alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-4)]-Beta-Dglucopyranoside；其他类型的甾体皂苷包括Pseudoprotoneodioscin和Aspacochioside D。研究发现，芦笋皂苷对结肠癌细胞[17]、人肝癌细胞[18]、肺癌细胞[19]以及子宫内膜癌细胞[20]等多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒活性，可使其凋亡或者抑制癌细胞生长。

图1 甾体皂苷类化合物结构

以ShatavarinⅨ为例说明甾体皂苷的鉴定过程。在正离子模式下，化合物1得到准分子离子峰m/z 903.4930[M+H]+,失去一分子葡萄糖(Glc)得到m/z 741.4403[M+H-Glc]+,继续失去一分子Glc得到m/z 579.3875[M+H-2Glc]+，再失去一分子Glc得到m/z 417.3350[M+H-3Glc]+。通过和Hayes等[21]报道的数据相比较，推测化合物1为ShatavarinⅨ。

2.3.2 黄酮类 在喷雾粉中共鉴定出8个黄酮类化合物，其苷元结构见图2。以异鼠李素为苷元的黄酮醇苷3个，包括Isorhamnetion-3-O-rutinoside-7-Oglucoside、Narcissoside和Isorhamnetin；以山奈酚为苷元的黄酮醇苷2个，包括Camelliaside A和Kaempferol-3-O-rutinoside；以槲皮素为苷元的黄酮醇苷3个，包括Quercetin diglucoside、Quercitin 3-Oglucosylrutinoside和Rutin。研究发现，芦笋黄酮对力竭大鼠、D-半乳糖衰老小鼠等模型具有抗氧化作用[22-23]，还可清除超氧阴离子自由基以及羟自由基[24]。

图2 黄酮类化合物苷元结构

在正离子模式，化合物9的准分子离子峰为m/z 611.1602[M+H]+,失去一分子鼠李糖(Rha)得到m/z 465.1029[M+H-Rha]+，进一步失去一分子Glc则得到其m/z 303.0498[M+H-Rha-Glc]+。该苷元可发生裂解得到m/z 147.0646,并进一步失去一分子H2O得到m/z 129.0542。通过和对照品的保留时间以及质谱碎片相比对和Hamdi等[25]报道的数据一致，确认化合物9为Rutin。

2.3.3 氨基酸 在喷雾粉中共鉴定到8种氨基酸，其中人体必需氨基酸4种包括L-valine、Isoleucine、Phenylalanine和Methionine；非必需氨基酸4种包括Aspartic acid、L-Arginine、Histidine、Pipecolic acid。膳食氨基酸在维持健康方面发挥着重要作用，不仅可以调节机体内分泌，还是免疫代谢物和免疫递质的主要来源[26-27]。

2.3.4 有机酸 在喷雾粉中共鉴定到8个天然有机酸，包括、Ferulic acid、Amber acid等。天然有机酸具有预防疾病和维护人体健康的功效[28]。例如，Ferulic Acid是一种酚酸类物质，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病等作用，广泛应用于医药、食品以及化妆品等行业[29]。

2.3.5 其他类 除了皂苷、黄酮、氨基酸和有机酸这些主要功效成分外，在喷雾粉中还鉴定出其他类化合物9个。例如，有机碱类化合物Vitamin B2，一种天然维生素，可抵抗多种疾病（如败血症、缺血等），同时也有助于降低人类患某些癌症的风险[30]。Diferuoloyl glycerol是水溶性阿魏酸的甘油脂类物质，可用作食品、化妆品、化学和医药工业的紫外吸收剂和抗氧化剂等[31]。

3 结论与讨论

进样流量、进样温度、料液密度是影响喷雾干燥的主要因素[47]，本研究着重从以上3个方面考察芦笋茎皮提取物的实验室喷雾干燥工艺。当进样温度过低、进样量过大或料液密度小、含水量大时，料液在干燥室内难以被完全干燥，颗粒容易粘在壁上，导致产率降低；温度过高、进样量过小，会使料液焦糖化、破坏料液中的活性成分、降低产品的营养价值和产率。Jafari等[48]试验发现，石榴喷雾干燥粉中的花青素含量随着温度的升高而降低；密度过大时，料液流动性差，固形物和辅料易沉淀，容易堵塞管道、损坏机器。当进样温度130℃、进样流量350 mL·h-1、料液密度1.07 g·cm-3时，芦笋茎皮喷雾粉粉质细腻、分散、粘壁量少、含水量低、湿度小、结块现象不明显，产率高。按照最优工艺平行制备3批芦笋茎皮喷雾粉，得率均大于50%，且最高可达61.31%，得率较高；溶化性较好，无明显杂质或沉淀；溶解度均大于97%，溶解度较好；润湿性小，不易吸潮；含水量≤7.0%,符合GB/T 29602—2013《固体饮料》国家标准，可作为长期储存的原料。

已有研究对芦笋茎皮的喷雾干燥工艺进行了考察，但未对其化学成分进行全面的分析和鉴定。高分辨质谱技术适用于中药材和食品中复杂成分的快速解析，本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对芦笋茎皮喷雾粉中的化学成分进行定性鉴别，共鉴定出38个化合物。其中含有皂苷类化合物5个，ShatavarinⅨ是芦笋中具有代表性的甾体皂苷，最新研究表明其可与新型冠状病毒（COVID-19）的蛋白酶受体SARS-CoV-2 Mpro紧密结合，抑制病毒的复制和转录，是一种潜在的天然抑制剂[49]；其他皂苷类化合物和Asparinin B、Asparagoside A等，同样具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等作用[50-51]黄酮类化合物8个,Rutin是芦笋中具有代表性的黄酮类化合物，Kalai等[52]发现Rutin可以抑制阿尔茨海默病小鼠模型中tau的聚集以及tau寡聚物诱导的细胞毒性，降低促炎细胞因子的产生，可预防阿尔茨海默病；其他的黄酮类化合物如Narcissoside、Isorhamnetin等，对糖尿病、高血脂、冠状病毒等也具有潜在的抑制作用[53-54]。其次，本研究还鉴定到8种氨基酸，8个有机酸、9个其他类型化合物，例如Ferulic acid，具有抗炎、抗菌、抗癌的功效，可预防疾病和维护人体健康；Vitamin B2，一种天然的维生素，可抵抗败血症等多种疾病；Diferuoloyl glycerol，可作为食品、医药、化工行业的抗氧化剂。

近年来，我国芦笋产业发展迅速，规模和产量已经达到了全球第一。相应的，其在生产加工过程中产生的废弃物也大量增加和积累，造成了一定的资源浪费和环境污染。通过查阅文献笔者发现，这些芦笋废弃物中不仅富含脂肪、蛋白质等营养成分，同样含有丰富的黄酮、皂苷等药用成分，具有极其可观的利用价值。本研究制备的喷雾粉很好地保留了芦笋中的活性成分，具有芦笋特有风味且营养丰富，可进一步加入其他辅料制备成固体饮料、代餐粉、泡腾片、含片等复合功能食品。