硒纳米颗粒对两种叶菜作物肥料效应的田间试验研究

刘晓飞，刘 晶，王传洗*，王震宇

1.江南大学环境与土木工程学院，江苏无锡 214122

2.江南大学环境过程与污染控制研究所，江苏无锡 214122

硒(Se)是人体必不可少的微量元素之一，被称为“生命的保护剂”[1].人体想要补充Se元素，目前被承认的最健康的方法是饮食补Se[2].然而，我国属于低Se地带，容易导致作物富Se量不足[3].发展富Se农产品产业成为农业结构调整的重要措施[4].常见的传统Se肥(如亚硒酸钠)容易被土壤固定，最终导致植物对Se的利用率较低，残留在土壤中的Se对环境和人体健康都存在一定威胁[5].硒纳米颗粒(Se NPs)的出现打破了僵局，低毒性和高生物活性等特性使其在农业领域的应用受到了广泛关注[6-7].

近年来，以纳米颗粒(NPs)生产的纳米肥料、纳米农药、纳米农业传感器等新颖纳米农业产品，在提高作物产量、提升作物品质和降低病虫害等方面已经显现出巨大潜力[8-10]. NPs在现代农业中的应用受到了全世界学者前所未有的关注[11-12].已有研究表明，Se NPs可用于改善茶叶的品质，与对照相比，Se NPs(10 mg/L)显著提高了蛋白质、可溶性糖、类胡萝卜素、茶多酚和儿茶素的含量[6].Li等[13]发现，叶施Se NPs(20 mg/L)可以激活苯丙烷和支链脂肪酸途径以及相关酶和基因表达，促进辣椒中辣椒素、类黄酮和总酚的合成，这些化合物具有抗炎、抗癌、抗氧化等保健功能.同时，笔者所在课题组的近期(2022年)盆栽试验发现，土壤施加Se NPs(0.5 mg/kg)能够增加油菜根际有益微生物的丰度及低分子量有机酸的含量，从而提高了土壤中养分的释放，促进植物对这些养分的吸收；同时，根系低分子量有机酸能够减少Se NPs在土壤中的固持，促进Se在作物内的吸收[14].然而，目前的研究大多在盆栽中进行.田间真实复杂环境下，Se NPs促进作物生长及品质的肥料效应研究较少.

该研究以小油菜和生菜两种作物为研究对象，通过比较传统Se肥(亚硒酸钠)和Se NPs对两种作物生长、富Se情况的影响，研究Se NPs对叶菜类作物促生和富Se的普适性，并探究Se NPs可能对土壤环境产生的影响，以期为Se NPs作为新型Se肥在农田应用中的可行性做进一步了解.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小油菜种子购自合肥合丰种业有限公司，发芽率不低于85%.供试生菜种子购自河北茂华种业有限公司，发芽率不低于85%.

Se NPs通过固相还原法制备[15].Se NPs的形貌和粒径通过透射电子显微镜(TEM，JEM-2100，日本)观察测定，表面电荷由纳米粒度仪(Nano ZS90，马尔文，英国)测定获得.

透射电子显微镜视野下，Se NPs的形貌呈球形〔见图1(a)〕；对Se NPs的粒径进行统计发现，其粒径主要分布在30~40 nm之间.Se NPs的Zeta电位在−31.45 mV左右〔见图1(b)〕.传统Se肥选择亚硒酸钠(Na2SeO3含量≥98%，国药集团化学试剂有限公司).

图1 Se NPs的透射电镜图和Zeta电位Fig.1 TEM and Zeta potential of Se NPs

1.2 试验设计

田间试验分别在江苏省无锡市滨湖区马山街道(小油菜，试验区海拔为3.4 m，地理位置31.4°N、120.1°E，单个小区面积为1 m×1 m，总面积为4 m×5 m)和江苏省苏州市昆山市千灯镇(生菜，试验区海拔为5.7 m，地理位置31.4°N、120.9°E，单个小区面积为1 m×1 m，总面积为7 m×10 m)进行，种植过程不施加化肥，田间土壤理化性质见表1.土施浓度根据已有研究[16]设置为0.05 mg/kg，分别设置无任何添加(CK)、添加Se NPs和添加亚硒酸钠(图表中表示为Selenite)共3个处理，每个处理重复3次.

表1 无锡滨湖区和苏州昆山市的田间土壤理化性质Table1 Physical and chemical properties of field soils in Binhu (Wuxi)and Kunshan (Suzhou)

1.3 测定方法

使用根扫仪(WinRHIZO Pro 2017b，Regent，加拿大)分析小油菜和生菜的根系参数(根长、根表面积、根体积).小油菜和生菜的生物量以每株地上部的鲜质量表示.

将干燥样品(植物样品25 mg，土壤样品15 mg)与3 mL去离子水和3 mL浓硝酸(GR，65%~68%)混合，在微波消解反应系统(Mars 6，CEM，美国)中消化.用0.22μm的微孔膜过滤后，用去离子水稀释至50 mL，待测.采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS，iCAP-TQ，Thermo Fisher，美国)分析不同处理下植物组织和土壤中元素(P、K、Fe、Cu、Zn、Mn、Mo和Se)的含量[17].标准曲线采用国家有色金属与电子材料分析测试中心(GNM-M203814-2013)的多元素标准溶液配置，内标元素为锗Ge(GSB 04-2826-2011，国家有色金属与电子材料分析测试中心)，各元素的加标回收率在84.9%~102.9%之间，仪器运行稳定.叶片和土壤中TOC、TN含量由元素分析仪(UNICUBE，ELEMENTAR，德国)测定[18].

采用2,6-二氯靛酚滴定法[19]测定小油菜叶片中的抗坏血酸(Vc)含量.

将50 mg新鲜叶片在液氮中均匀研磨，置于2 mL离心管中，加入1.5 mL 80%甲醇水溶液(含0.1%甲酸和内标液)进行涡流混合.冰浴超声30 min(35 kHz)后，将上清液(12 000 r/min，4℃)离心15 min.用离心浓缩机真空干燥上清液，再溶于200μL的复溶液(V甲醇∶V乙腈∶V水=4∶4∶2)中. 离心(12 000 r/min，4℃)10 min得到上清液，−20℃下保存待测.以L-2氯苯丙氨酸为内标，取各样品等量混合均匀作为质控样品(QC).采用超高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS，Thermo Fisher，德国)分析代谢产物[20-21].

1.4 数据处理

测定数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用OriginPro 2019b程序进行制图.采用单因素方差分析比较不同处理之间的差异.分析结果采用Fisher/Tukey检验，P<0.05认为差异具有统计学意义.采用Compound Discoverer software 3.1和Metabo Analyst(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)进行质谱数据分析.

2 结果与讨论

2.1 Se NPs对小油菜和生菜生物量的影响

在农田生态环境中土施Se NPs(0.05 mg/kg)可促进小油菜的生长.与CK相比，Se NPs可以显著提高小油菜的根长、根表面积、根体积以及生物量，其中根表面积和根体积分别提高了47.4%和52.0%〔见图2(A)~(C)〕，小油菜的地上可食用部位的鲜质量较CK增加了108.2%〔见图2(D)〕.

将Se NPs应用于土施培养生菜，发现Se NPs同样促进了生菜的生长.Se NPs可促进生菜根系的生长，与CK相比，根长、根表面积和根体积分别提高了53.8%、74.7%和85.7%〔见图2(A)~(C)〕，地上部鲜质量增加了90.9%〔见图2(D)〕.因此，农田环境中施用Se NPs提高叶菜类作物生物量是可行的，然而农田环境中施用同浓度的亚硒酸钠对叶菜类作物的促生效果并不理想.在施用亚硒酸钠后，生菜和小油菜的根长、根表面积以及生物量与CK相比均无统计学差异，只有生菜的根体积在施用亚硒酸钠后与CK相比增加了79.1%.因此与亚硒酸钠相比，土施Se NPs对叶菜类作物的促生效果更显著.

图2 Se NPs和亚硒酸钠对叶菜类作物生长情况的影响Fig.2 Effects of Se NPs and sodium selenite on the growth of Brassica chinensis L.(rapeseed)and Lactuca sativa L.var.ramosa Hort (lettuce)

2.2 农田环境中Se NPs对小油菜和生菜微量元素的影响

施用Se NPs可以促进叶菜类作物中微量元素的积累.与CK相比，Se NPs处理组小油菜叶片中Fe、Cu、Zn、Mn、Mo和Se的含量分别提高了48.1%、18.9%、38.7%、9.6%、102.6%和185.7%；同样，生菜叶片中Cu、Zn、Mn、Mo和Se的含量分别提高了8.5%、28.6%、72.2%、51.9%和60.4%(见表2).Fe和Mn均是光合作用的重要元素，Fe是植物体叶绿素合成的重要元素[22]，Mn是光系统Ⅱ中四锰团簇(Mn4)的必需元素，在光合作用放氧反应中起到重要作用[23].因此，农田环境中Se NPs可以通过分别调控小油菜和生菜对Fe和Mn的积累，对光合作用产生影响，最终促进生物量的提升.

表2 Se NPs对农田环境中小油菜和生菜微量元素的影响Table2 Effectsof Se NPs on trace elements of rapeseed and lettuce in farmland environment

此外，在土施Se NPs后，小油菜中Se含量增加了200.9μg/kg，而生菜中Se含量增加了119.2μg/kg，这可能是受到了土壤有机质的影响.土壤中的有机质可以增加土壤表面的负电荷量，降低负电荷Se NPs被土壤吸附固定的可能性[24].无锡滨湖大田(青菜)中土壤有机质含量高于江苏昆山大田(生菜)，其土壤中Se NPs不容易被固定，具有较高的有效性；此外，植物吸收硒还与植物种类有关，一般作物中十字花科植物对硒的积累能力最强[25]，这也可能是小油菜富硒效果更好的原因.

2.3 农田环境中Se NPs对小油菜和生菜营养品质的影响

2.3.1 Se NPs对小油菜和生菜叶片Vc含量的影响

土施Se NPs可以促进叶菜类作物叶片中Vc水平的提高(见图3).结果表明，农田环境中土施Se NPs使小油菜Vc含量提高了127.5%，其次，亚硒酸钠也在一定程度上提高了小油菜的Vc含量；同样，Se NPs使生菜的Vc含量提高了约23.1%.研究发现，生菜中的Vc水平低于小油菜中的Vc水平，这可能与叶片中的Se含量有关(Se更容易在小油菜中富集).研究表明，Se NPs能够促进小油菜的光合作用，增加Vc的含量[24].

图3 Se NPs对小油菜和生菜Vc含量的影响Fig.3 Effectsof Se NPs on Vc content in rapeseed and lettuce

2.3.2 农田环境中的小油菜叶片代谢组学分析

通过上述分析可知，与生菜相比，小油菜的相关生理生化以及代谢指标可能变化更显著.因此，该研究以小油菜为研究对象，利用代谢组学分析方法详细分析Se NPs对叶菜类作物营养品质的影响.如图4所示，小油菜的代谢产物主要归属于氨基酸代谢途径(24.3%)和类黄酮代谢途径(6.8%).此外，与CK相比，Se NPs处理后的小油菜中归属于氨基酸和类黄酮代谢途径的代谢产物相对丰度分别提高了22.7%和37.1%(见图5).

图4 小油菜叶片中代谢产物的分类Fig.4 Classification of metabolites in leaves of rapeseed

图5 小油菜叶片中氨基酸和类黄酮的相对丰度Fig.5 Total relativeabundance of amino acidsand flavonoids in leavesof rapeseed

氨基酸和类黄酮对人体健康有极大的益处[26].对小油菜代谢产物中几种氨基酸的分析发现，与CK相比，施用Se NPs处理组的小油菜中苯丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸的相对丰度分别提高了26.8%、31.6%和39.1%〔见图6(A)〕.同样，小油菜经过Se NPs处理后，叶片中的槲皮素、山奈酚和异鼠李素等三种类黄酮的相对丰度分别较CK提高了206.0%、100.4%和41.8%〔见图6(B)〕.这些化合物具有抗炎、抗癌、抗氧化等保健功能[27].综上，施用Se NP可以分别提高小油菜的4种代谢途径(氨基酸，黄酮类化合物，脂肪酸及其共轭物，以及TCA酸类化合物)中代谢物的相对丰度，提升了其营养价值，有利于促进人体健康发展.

图6 Se NPs对小油菜中3种氨基酸和类黄酮相对丰度的影响Fig.6 Effectsof Se NPs on the relative abundanceof three amino acids and flavonoidsin rapeseed

2.4 农田施用Se NPs对土壤理化性质的影响

为了符合农田的可持续发展，减少对农用土地的污染，将Se NPs推广到农田，需要考虑到Se NPs施用对土壤理化性质的影响.对比无锡滨湖区大田(小油菜)和江苏昆山市大田(生菜)施用Se NPs后的土壤理化性质(见表3)发现，与CK相比，土壤pH和TOC含量都没有明显变化.

表3 小油菜、生菜收获后土壤的理化性质Table3 Soil physicochemical properties of rapeseed and lettuce after harvest

这与已有的盆栽试验结果存在差异，Wang等[14]发现，Se NPs可以引起根际土壤中有机质含量的增加以及土壤pH的降低.因此，导致农田和盆栽试验最终的土壤性质存在差异的原因可能是，较低的pH使得土壤具有良好的酸碱缓冲能力[28]，复杂的农田生态环境会引起进入土壤中的有机质分解速度加快[29].但是Se NPs处理组的土壤TN含量有了一定程度的降低，这与前期盆栽结果[14]一致.SeNPs的施用可能改善了土壤微环境，活化土壤养分并提高了叶菜类作物对其的吸收.这些结果进一步证实了Se NPs在减少农用氮肥成本以及减轻环境污染方面的优势.此外，更需要关注的是，与传统Se肥(亚硒酸钠)对比，Se NPs施用后的土壤中Se残留量更低，这也说明更多的Se被植物有效吸收和利用，降低了Se残留在土壤中可能造成的环境风险.

3 结论

a)与传统Se肥(亚硒酸钠)对比，农田施加硒纳米颗粒(Se NPs)显著促进了两类叶菜作物(小油菜和生菜)的根系生长，增加了作物对土壤微量元素的吸收，进而提升了叶菜类作物的光合作用和生物量.

b)与传统Se肥对比，农田施加Se NPs不仅使得叶菜类作物含Se量更高，而且显著提高了叶菜类作物的营养品质，有助于改善人体健康.

c)与传统Se肥对比，Se NPs的施用可以降低土壤中的Se残留量，提高氮素利用率，达到减轻环境污染、降低环境风险的目的.