餐厨垃圾接种酵母菌固态厌氧发酵产乙醇的可行性研究

王铭，全文洁，尚洪磊，龚天成，杨天学*，席北斗

1.贵州民族大学生态环境工程学院，贵州贵阳 550025

2.中国环境科学研究院，北京 100012

随着经济发展和人民生活水平的进一步提高，我国生活垃圾产量逐年增加，2020年达到2.35×108t[1]，厨余垃圾是生活垃圾的主要组成，包括餐厨垃圾、家庭厨余垃圾和其他厨余垃圾[2]，占生活垃圾总量的36%~52%[3]，由于含水率和有机物含量高、可生化性强等特性[4]，收集和储存过程中容易发生腐烂变质[5]，并易产生渗滤液污染、臭气等二次污染问题，容易引发传染病，危害人体健康[6-8].通过厌氧发酵将厨余垃圾转化成燃料乙醇是其资源化处理技术之一，日益受到研究和工程技术人员的重视[9-10].

为提高乙醇产量，已有学者进行了厨余(餐厨)垃圾预处理等复杂过程后产乙醇的研究，如Matsakas等[11]开展了厨余垃圾水热预处理后生产乙醇的研究，结果显示最终乙醇产量为107.58 g/kg〔以总固体(TS)计〕，比未水热预处理的乙醇产量增加了13.16%；另有研究人员通过生物酶促反应来进行预处理，如Walker等[12]将厨余垃圾酶解后进行乙醇发酵，最终乙醇浓度为8 mg/mL；曹铭等[13]利用经过复合酶预处理后的餐厨垃圾生产乙醇，最终乙醇浓度达54 g/L；Zhao等[14]使用微波预处理餐厨垃圾的酶水解产物作为底物，最终乙醇产量为0.344 g/g(相当于理论乙醇产量的93.1%).另外，通过灭菌与强化微生物结合以及糖化等预处理方法，也可以提高乙醇的产量，如刘爱民等[15]将灭菌后的餐厨垃圾经根霉和枯草芽胞杆菌预处理后生产乙醇，乙醇产量最高达6.67%；高明等[16]将餐厨垃圾进行糖化预处理并结合糟液回流技术生产乙醇，最终乙醇产量维持在25.5~35.5 g/L.

目前厌氧发酵产乙醇预处理阶段仍存在工艺流程复杂、时间长、成本高等难题，曹铭等[13]研究指出，餐厨垃圾制乙醇生产具有预处理步骤繁琐、成本高的问题，且发现餐厨垃圾底物复杂、黏度大，严重影响酶解效率，选用高效液化酶和糖化酶复配能够降低原料黏度、提高传质效率，得到的预处理效果更优；仉磊等[17]研究发现，纤维素酶等水解酶的大量使用会使生产成本大幅提升，酶解预处理成本高是目前利用生物质制备乙醇工艺的难题.灭菌预处理也存在类似问题，如刘爱民等[15]将餐厨垃圾灭菌后添加根霉孢子悬浊液预处理4 d，再添加芽胞杆菌悬浊液预处理1 d，利用得到的糖化液进行乙醇发酵，虽产乙醇效果较好，但预处理过程相对复杂；张坤等[18]发现，相比于未处理的餐厨垃圾，灭菌预处理后其产气提升效果不明显，获得的效益提升与消耗的能量成本相比得不偿失.另外也有学者尝试将乙醇前提物提取出来进行发酵，如李英[19]在进行餐厨垃圾厌氧发酵研究时，利用淋滤水解技术对餐厨垃圾进行分离提质预处理，虽然提高了发酵效果，但增加了大量的预处理时间.此外，预处理阶段需要对厨余垃圾的产乙醇前体物还原糖的水解生成量以及还原糖水解前体物淀粉进行控制，以保证厌氧发酵中乙醇生成路径的通畅[15-16].

传统餐厨垃圾厌氧发酵产甲烷是主流技术工艺路径[10]，其物质转化流程为有机物−乙醇−乙酸−甲烷，产乙醇是厌氧发酵重要的前置环节；通过有机物快速转化为乙醇，可以避免反应无序产生其他次生代谢物[13]，提高餐厨垃圾厌氧发酵水平.该研究拟通过直接向未进行处理的餐厨垃圾中接种酵母菌，分析直接接种酵母菌发酵系统内乙醇的产生量，并与灭菌预处理发酵产乙醇情况进行对比，深入分析乙醇前体物还原糖以及还原糖水解前体物淀粉的降解规律，从而为餐厨垃圾收储过程臭气控制、物质资源化提供理论和技术支撑.

1 材料与方法

1.1 试验原料

餐厨垃圾取自北京市某单位食堂，经初步分拣，用小型粉碎机打成浆后于−18℃下冷冻保存.物料基本理化特性：总固体含量(total solid,TS)为15.00%，挥发性固体含量(volatile solid,VS)为13.40%，总糖含量为57.95%，还原糖含量为12.81%，淀粉含量为43.90%，pH为4.2.

1.2 试验方案

共设置2组试验，分别为底物灭菌预处理试验组和直接接种试验组，基于前期预试验的研究结果，将酵母菌接种量(m/m)分别设定为0、3%、6%、9%，其中，灭菌预处理试验组依次记为t1(空白)、t2、t3、t4，直接接种试验组依次记为T1(空白)、T2、T3、T4；厌氧发酵时间梯度分别设定为0、4、8、12、16、20和24 h(每个时间点取1瓶进行测试)，试验总计使用56个500 mL血清瓶，其中每个血清瓶中装有250 g餐厨垃圾，于28℃恒温条件下进行，试验开始前通入氮气以确保厌氧环境.所用酵母菌种为安琪活性干酵母菌，接种方式为粉料直投，每个血清瓶上方连接2个集气袋收集反应产生的气体，进行后续指标测定.

1.3 指标测定方法

试验原料成分测定：总固体、挥发性固体含量采用重量法测量，将总固体于105℃的恒温烘箱中烘至恒质量，挥发性固体于550℃马弗炉中灼烧至恒质量，称量后计算其含量；pH采用pH计(梅特勒托利多FE20K，美国)测定；还原糖含量采用可见分光光度法测定[20]；淀粉含量采用蒽酮比色法测定；乙醇浓度采用气相色谱法测量[21]，所用仪器为气相色谱仪(安捷伦7890B，美国).

1.4 分析方法

采用修正的Gompertz模型〔见式(1)〕分析乙醇发酵动力学过程[22]，该研究通过对浓度和时间的关系曲线进行拟合，判断发酵的延滞期以及发酵底物的产乙醇潜能.

式中：y为累积乙醇产量，g/L；Rm为单位最大乙醇产率，g/(L ·h)；Pm为最终乙醇潜力，g/L；e为自然常数，其值为2.713；λ为延滞期，h；t为发酵时间，h.

数据处理及图表绘制运用Originpro 2021软件，并运用Auto2Fit软件对模型的各参数进行回归分析，通过全局优化算法进行迭代运算，最终得到各参数值.

2 结果与讨论

2.1 乙醇产生规律及其动力学

2.1.1 酵母菌强化产乙醇效果

发酵基质中乙醇浓度及其变化规律可以反映接种酵母菌对餐厨垃圾固态厌氧发酵的影响及效果.如图1所示，直接接种组和灭菌预处理组的不接种空白对照(T1组、t1组)中，乙醇浓度在发酵的0~24 h内均处于较低水平，且接种酵母菌(T2组、T3组、T4组、t2组、t3组、t4组)后乙醇浓度是未接种(T1组、t1组)的8.41~31.50倍，说明酵母菌的添加能够促进餐厨垃圾固体厌氧发酵产生乙醇，这与刘爱民等[15]发现酵母菌可以促进餐厨垃圾厌氧发酵产生乙醇的研究结果一致，主要是因为酵母菌具有将还原糖转化为乙醇的功能[23-24]，且餐厨垃圾能够成为酵母菌生长繁殖的营养基质[25]，因此，接种酵母菌能够提升发酵系统内乙醇浓度.

图1 厌氧发酵系统乙醇浓度的变化Fig.1 Changes of ethanol concentration in anaerobic fermentation system

另外，餐厨垃圾直接接种的T2、T3、T4试验组乙醇浓度最大值在11.86~12.09 g/L之间，明显高于餐厨垃圾经灭菌后再接种酵母菌的试验组，说明直接接种酵母菌的产乙醇效果优于灭菌预处理组，这是由于餐厨垃圾中原有的杂菌对乙醇发酵具有积极作用，可能由于餐厨垃圾中存在细菌[26]、真菌[27]等微生物，能够促进餐厨垃圾中的有机物水解产生还原糖，接入的酵母菌能够将还原糖转化为乙醇，从而提高了乙醇产量；也有可能是由于餐厨垃圾中本就含有能够将还原糖转化为乙醇的微生物，它们与接入的酵母菌一起将还原糖转化为乙醇[28-29].

2.1.2 产乙醇动力学

为了量化分析酵母菌接种量对产乙醇过程的影响，该研究基于修正的Gompertz模型进行乙醇产生动力学分析[30]，结果(见表1)显示，拟合得到的R2为0.874~0.996，均大于0.85，拟合程度较高，说明接种酵母菌产乙醇发酵符合修正的Gompertz动力学方程.

Pm值的大小可以反映出发酵系统产乙醇的潜力大小，从表1可以看出，未接种试验组Pm仅为1.28 g/L，远低于接种组，且随着酵母菌接种量的增加，Pm不断升高，与此同时，代表单位容积时间情况下最大乙醇产率的Rm与Pm的变化趋势相一致，空白对照组Rm仅为0.21 g/(L ·h)，远小于接种试验组，说明接种酵母菌可以增加餐厨垃圾固态发酵产乙醇的潜力.但是，随着酵母菌接种量由3%升至9%，Pm仅由10.75 g/L升至11.51 g/L，而T2、T3和T4试验组的Rm分别为3.29、3.25和3.88 g/(L ·h)，未表现出上升趋势，说明在该试验条件下，酵母菌接种量对餐厨垃圾产乙醇的潜力影响不大.

表1 不同接种条件下修正的Gompertz模型参数Table 1 Parameters of the modified Gompertz model for different inoculum conditions

2.2 乙醇前体物还原糖的产生情况

还原糖是产乙醇重要的前体物，分析其含量变化可反映乙醇产量受发酵底物中营养物质的影响.由图2可见，虽然各试验组还原糖含量总体上均呈降低趋势，但0~4 h内空白对照组还原糖含量出现小幅上升，而接种试验组还原糖含量快速下降为43.37~46.55 mg/g，降幅为64.89%~67.29%，这说明接种酵母菌能够在发酵初期就可以发挥作用，快速将系统内的还原糖转化为乙醇，这与乙醇浓度的分析结果相一致.另外，也可以说明接种酵母菌能够加速系统内不稳定物质向乙醇的转化[31]，避免还原糖在其他类型微生物的作用下向丙酸、丁酸、甲烷等物质转化[26]，从而加速餐厨垃圾的稳定化进程，减少二次污染物的产生[32].

图2 各试验组还原糖含量的变化Fig.2 Changesin reduced sugar content in each experimental group

另外，从图2还可以看出，在4~24 h内，系统内还原糖含量基本趋于稳定，未出现明显的上升和下降趋势，可能是发酵系统内还原糖未产生和降解，或者产生量和转化量出现平衡状态，但是关联乙醇产生规律可知，该时间段内接种酵母菌的试验组乙醇含量也未出现明显的上升或下降趋势，说明系统内还原糖的状态是未出现明显的产生和降解，主要是由于乙醇的累积作用抑制了微生物的活性[33]，还原糖含量或者乙醇浓度可能成为乙醇产生的限制因素[34].与此同时，3个接种试验组(T2、T3、T4)的还原糖含量上升趋势和最高含量均未出现明显差异，再叠加发酵系统内乙醇产生量并未随着接种量的增加而发生明显变化，说明酵母菌接种量对于餐厨垃圾中有机物水解产生还原糖的速率没有影响，可能是因为受还原糖的水解前体物淀粉浓度的限制，无法满足更多酵母菌水解作用[35].

2.3 还原糖前体物淀粉的产生情况

为了进一步分析系统内停止产生还原糖是否受其前体物淀粉的影响，该研究对发酵基质中的淀粉进行了检测分析，结果如图3所示，空白对照组淀粉的最大水解率为19.36%，明显低于接种组，说明接种酵母菌可以显著增加餐厨垃圾固体发酵系统内淀粉的水解率[36].淀粉含量的差异主要发生在0~4 h内，这可能是由于酵母菌接种量的增加增强了系统内微生物的丰度[37]，从而提高了淀粉水解速率[38].与此同时，随着发酵的进行，接种酵母菌的试验组中淀粉含量均出现下降，但0~24 h内淀粉水解率仅为27.90%~37.57%，发酵24 h后，淀粉含量(274.02~316.51 mg/g)仍较高，说明系统内还原糖停止产生不是由于淀粉的不足导致的，可能是由于随着发酵的进行，产生的一些次生代谢物(如NaCl、油脂类等物质)抑制了淀粉的水解[39]，因此，如果要进一步提升餐厨垃圾固态发酵产乙醇的效率，提高淀粉水解产生还原糖成为亟待解决的难题.

图3 各试验组淀粉含量的变化Fig.3 Change of starch content in each experimental group

3 结论

a)餐厨垃圾直接接种酵母菌进行厌氧发酵，可以促进乙醇的产生，乙醇浓度最高为11.86~12.09 g/L，是未接种情况下的8.41~31.50倍.直接接种的产乙醇效果优于灭菌后再接种的效果，修正的Gompertz模型分析也佐证了接种酵母菌能够显著提高餐厨垃圾固体发酵产乙醇的水平，并且随着接种量的增加，乙醇产生速率和总量也不断上升.

b)接种酵母菌可促使系统内还原糖转化为乙醇，还原糖的降解率由32.90%升至69.26%，尤其是在0~4 h内，接种组还原糖降解量占整个发酵过程的64.99%~67.29%，但4~24 h内系统内还原糖含量基本维持在40.76~46.87 mg/g之间，也导致系统内乙醇产生量处于较低水平，成为乙醇产生的限制因素.

c)接种酵母菌可以显著增加餐厨垃圾固体发酵系统内淀粉的水解率，淀粉水解效率由空白对照组的19.36%升至27.90%~37.57%，且淀粉含量的差异主要发生在0~4 h内，空白对照组淀粉含量的下降速率明显低于接种组；但发酵24 h后，淀粉含量(274.02~316.51 mg/g)仍较高，可见，提高淀粉水解产生还原糖成为提升餐厨垃圾固态发酵产乙醇的效率亟待解决的难题.