中性粒细胞胞外诱捕网水平联合肺功能指标对支气管哮喘急性发作的预测价值

周伟勇，吴 升

开平市中心医院呼吸内科，广东 开平 529300

支气管哮喘是一种由呼吸道过敏引起的，以支气管可逆性发作性痉挛为特征的慢性阻塞性炎性疾病。临床表现为反复发作的伴有哮鸣音的呼气性呼吸困难、咳嗽、胸闷等症状。由于支气管哮喘的病因复杂，有通过接触灰尘和花粉等引起哮喘的过敏原，还有因为服用药品引起的支气管哮喘。支气管哮喘的发作机制也十分复杂，临床对于支气管哮喘的诊断既没有金标准，也没有实验室检查指标能够明确预测支气管哮喘，故临床对于支气管哮喘的诊断依托于患者的主诉，查体和肺功能检查。这种确诊方式也有其局限性：一是肺功能检查能否准确地反映患者气道情况取决于患者的依从性，若患者为儿童，不能按要求正确进行检查，会造成肺功能检查结果不准确；若患者为老年人，随着年龄增大，并且多种心血管疾病与呼吸疾病并存，常常会有呼吸困难的症状，这样的情况进行肺功能检查得到的结果不够准确，不能够正确反映患者的气道情况。二是肺功能检查结果只能反映呼吸道的气流状况，不能检测呼吸道是否有炎症，但在诊断哮喘时呼吸道炎症的诊断是核心要素［1］。中性粒细胞是炎症反应时最早出现的细胞［2］，当中性粒细胞受到刺激后，释放到胞外的一种网状结构成为中性粒细胞胞外诱捕网，故临床可以通过检验中性粒细胞胞外诱捕网水平评价呼吸道的炎症状况。本研究旨在探究中性粒细胞胞外诱捕网水平联合肺功能指标对支气管哮喘急性发作的预测价值，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年2—12月开平市中心医院呼吸内科收治的90例主诉喘息、胸闷、气短患者作为研究对象。纳入标准：（1）患者主诉反复的喘息、气急，咳嗽，且发作时间常常夜间及晨间多发，在接触到冷空气或者各种呼吸道的刺激及运动后症状明显。（2）有过以往支气管哮喘发作史，并且使用相关药物症状得到改善。（3）患者病程为急性发作期，听诊时双肺可听到弥漫性哮鸣音，呼气相延长。患者符合上述（1）（3）症状，并且肺功能检查任意一项为阳性患者归为支气管哮喘急性发作组。患者有上述（1）（2）症状，并且肺功能检查任意一项为阳性列为支气管哮喘非急性发作组。（4）患者具有良好的依从性。

支气管哮喘急性发作组（45例），男性患者30例，女性患者15例；年龄15～67岁，平均年龄（43.04±12.77）岁。支气管哮喘非急性发作组（45例），男性28例，女性17例；年龄12～71岁，平均年龄（46.07±13.65）岁。两组患者一般资料具有可比性（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 检测方法

1.2.1 肺功能检查 （1）支气管激发试验：采用不同的刺激物去引发支气管不正常的收缩，通过刺激物的量化及其相应的反应程度，去判断气道高反应性的程度，只针对非急性期患者进行试验。（2）支气管舒张试验：患者用力呼气，记录第一秒呼气容积，吸入支气管舒张剂后，再记录第1 s用力呼气容积，若第1 s用力呼气容积增加＞12%，且第1 s用力呼气容积增加绝对值＞200 mL，则支气管舒张试验阳性。（3）呼气流量峰值（PEF）平均每日昼夜变异率：患者早上起床后使用肺功能检查峰流量计测量呼气流量峰值，保持站立位，患者快速深吸一口气至肺总量位，迅速将咬口含入口腔，用嘴唇包紧，立即用最大力气和最快速度将肺内气体呼出，检查结束后峰流量计应继续保持水平位，读取数值。至少检查3次，若3次实测值之间差异过大，应注意检查方法是否正确。可重复多次，使最佳3次之间差异＜5%，取最高值记为呼气流量峰值，晚上入睡前重复此步骤，连续监测2周，将每天的变异率相加除以监测天数（最少7 d）以计算呼气流量峰值平均变异率，每日呼气流量峰值昼夜变异率之和/7）＞10%，则为阳性；或以2周内呼气流量峰值最高值和最低值计算呼气流量峰值周变异率，（2周内最高PEF-最低PEF）/［（2周内最高PEF+最低PEF）×1/2］×100%］＞20%［3］，则为阳性。

1.2.2 中性粒细胞胞外诱捕网水平检查 购买小牛胸腺DNA干粉（北京百奥莱博科技有限公司）后，用倍比稀释方法稀释后，加入PicoGreen工作液并混匀，用荧光酶标仪于在485 nm波长处的发射荧光下快速检测，以小牛胸腺DNA干粉对应的荧光强度作为标准曲线，抽取两组患者的血液，将待测血液与PicoGreen荧光探针工作液进行混合，使用荧光酶标仪于在485 nm波长处检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行分析。分别对各组资料进行统计学描述。其中计量资料符合正态分布且方差齐时采用t检验，不符合正态分布且方差不齐时采用秩和检验。计数资料比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的肺功能指标情况

急性发作组患者的肺功能检查阳性率为100%，非急性发作组患者的肺功能检查阳性率为40%，差异有统计学意义（χ2=35.767 2，P＜0.01）。

2.2 两组患者中性粒细胞胞外诱捕网水平情况

急性发作组患者的中性粒细胞胞外诱捕网水平为（1 505.04±210.90），非急性发作组的中性粒细胞胞外诱捕网水平为（1 015.71±247.76），差异有统计学意义（t=10.088 7，P=0）。

2.3 支气管哮喘急性发作期logistic回归分析

2.3.1 影响患者支气管哮喘急性发作的控制变量筛选 患者的性别对患者支气管哮喘急性发作，差异有统计学意义（P＜0.05），患者的年龄对支气管哮喘急性发作，差异无统计学意义（P＞0.05），患者的性别对支气管哮喘发作的影响构成混杂影响，见表1。相关因素赋值，见表2。

表1 患者支气管哮喘急性发作的控制变量筛选 例

表2 相关因素赋值

经霍斯默—莱梅肖检验，差异无统计学意义（χ2=7.65 0，P=0.468），二元logistic回归模型与真实数据拟合良好。性别对支气管急性发作的影响（P=0.979），不是支气管哮喘急性发作的独立影响因素；肺功能指标对支气管急性发作的影响（P=0.998），故在支气管哮喘急性发作与支气管非急性发作中肺功能指标不构成影响因素；中性粒细胞胞外诱捕网水平对支气管急性发作的影响，在支气管哮喘急性发作与支气管非急性发作中，中性粒细胞胞外诱捕网水平差异明显，可以显著影响支气管哮喘的急性发作，排除混杂因素的影响后，OR=1.009，中性粒细胞胞外诱捕网水平每提高一个单位，患病风险提高0.9%，见表3。

表3 中性粒细胞胞外诱捕网水平和肺功能指标对支气管哮喘急性发作线性回归分析结果

3 讨论

支气管哮喘是一种气道高反应性炎症疾病，受到多种影响因素影响：一是由于个体基因遗传导致的个体差异性大，使得有个体超敏体质的患者更容易受到变应原的影响，每个个体对变应原的反应都不同。二是环境中的变应原多种多样，空气中的尘螨、花粉、动物皮毛都会引起气道的炎症形成与气道高反应性，甚至导致气道重构。变应原刺激呼吸道诱导多种炎症细胞聚集在呼吸道部位，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。炎症细胞聚集在呼吸道部位，气道高反应性是长期慢性气道炎症的结果，表现为患者接触变应原时气道出现的过强或过早的收缩反应。肺功能检查是检查患者的气道反应性的项目，可以反映出患者的气道状态，但是气道反应性是炎症长期慢性作用的结果，肺功能检查无法检查出现在气道的炎症状况，故临床可以通过肺功能检查联合患者的主诉与体征对患者进行确诊，但无法确定患者此时气道的炎症状况。确定患者的炎症状况是支气管哮喘诊断的核心，这将直接影响患者后续的治疗方案。

中性粒细胞是炎症细胞的一种，还包括嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞等，中性粒细胞可以吞噬病原体并在胞内释放颗粒内容物和活性氧杀害病原体，发挥其天然免疫功能，中性粒细胞也可将颗粒内容物和活性氧释放到细胞外空间，破坏周围的外来物［5］。中性粒细胞分泌的组蛋白、DNA和蛋白酶就会在细胞外形成交织的网状结构［6］，这种网状结构就是中性粒细胞胞外诱捕网。其在呼吸道部位是机体防御变应原时形成的保护机制，但是同时中性粒细胞胞外诱捕网的形成也会介导炎症介质的释放，引起呼吸道部位的黏膜水肿，并且中性粒细胞胞外诱捕网也会损伤自身细胞，损伤气道上皮细胞，诱导炎症细胞分泌黏液，刺激患者的气道出现高反应性，导致气道阻塞，患者呼吸困难与喘憋加重，加重哮喘症状［7］，并且中性粒细胞可以减少肺泡巨噬细胞降解中性粒细胞胞外诱捕网的能力，使得这种不良的循环持续存在，使支气管哮喘持续发生［8］。

中性粒细胞胞外诱捕网是气道炎症反应形式的一种，故中性粒细胞胞外诱捕网的检测可以反映呼吸道的情况。支气管哮喘根据发病情况可分为急性发作期，慢性持续期与缓解期。根据哮喘的分期不同采用不同的治疗方案，与急性期不同，慢性持续期与缓解期，患者的气道未处于痉挛的状态，气道的炎症反应也未处于炎症风暴，故对患者的药物使用剂量，治疗方案都要相互区别，临床对急性期与非急性期的鉴别尤为重要。中性粒细胞胞外诱捕网的检测为急性期与非急性期的鉴别提供了一种临床思路。

目前，对于中性粒细胞胞外诱捕网水平的检测采用PicoGreen荧光染色法，中性粒细胞会释放到胞外DNA，故临床可以通过检验血液中DNA的水平来评价中性粒细胞胞外诱捕网水平。PicoGreen荧光染色法是一种使用Pico-Green荧光染料与样品中双链DNA的高度特异性结合而产生荧光信号，再使用Modlus荧光检测仪定量检测DNA含量的方法。传统检测DNA的方法是直接检测在260 nm处的光吸收值，不仅双链DNA，单链DNA，RNA和其他杂质也会产生吸收值，这样通过DNA水平去评价中性粒细胞胞外诱捕网水平不准确。通过PCR扩增后进行通过电泳检测DNA，但是这种方法无法确定DNA是否来自中性粒细胞胞外诱捕网，还是来自组织的破裂，并且过程容易受到环境的污染［9］。PicoGreen是一种和DNA特异性络合的分子探针，在485 nm波长处发射黄光，与RNA和单链DNA结合无荧光，并且发射荧光的强度与DNA的浓度成正比。可以实现定量检测DNA来评价体内中性粒细胞胞外诱捕网水平。

据相关研究表明，支气管哮喘根据炎症细胞浸润的类型可以分为中性粒细胞表型、嗜酸性粒细胞表型、嗜碱性粒细胞表型。根据支气管哮喘急性发作期的治疗方案，给予患者β2受体激动剂扩张支气管，联合糖皮质激素发挥抗炎作用。有研究［10］表明，对支气管哮喘患者使用糖皮质激素发挥抗炎作用时，糖皮质激素对有些中性粒细胞表型患者无效，反而加重病程，这是因为糖皮质激素对嗜酸性粒细胞型支气管哮喘具有良好的治疗作用，但是对一些哮喘患者来说，肺部灌洗液中中性粒细胞和中性粒细胞胞外诱捕网水平的数量远远超过肺内嗜酸性粒细胞的数量。故急性发作期患者的用药方案根据中性粒细胞胞外诱捕网水平将更具有针对性，重组人DNase与糖皮质激素结合使用治疗哮喘对中性粒细胞型支气管哮喘更有效［11］。

本研究结果显示，急性发作组患者的肺功能检查阳性率显著高于非急性发作组，急性发作组患者的中性粒细胞胞外诱捕网水平显著高于非急性发作组，在本研究中性别不是支气管急性发作的独立影响因素。肺功能指标在支气管哮喘急性发作与支气管非急性发作中不构成独立影响因素，故临床通过肺功能指标可以区分支气管哮喘与非哮喘，但是无法准确区分急性发作期与非急性发作期。中性粒细胞胞外诱捕网水平对支气管急性发作的影响明显，可以显著影响支气管哮喘的急性发作，排除混杂因素的影响后，中性粒细胞胞外诱捕网水平每提高一个单位，患病风险提高0.9%，故临床通过检测中性粒细胞胞外诱捕网水平联合肺功能指标检查对支气管哮喘急性发作有预测作用。